Определение эупарена и его метаболита в воде, виноградном соке, вине, винограде, землянике и биосубстратах тонкослойной хроматографией
Определение эупарена и его метаболита в воде, виноградном соке, вине, винограде, землянике и биосубстратах тонкослойной хроматографией
УТВЕРЖДЕН 31.07.1973 N 1112-73
Действующее начало эупарена - N-(дихлорфторметил)-тио-N'-диметил-N-фенил-сернокислый диамид с относительной молекулярной массой 333,0. В щелочной среде легко гидролизуется и переходит в метаболит - N', N'-диметил-N-фенил-сернокислый диамид с относительной молекулярной массой 200,0.
(CH
)
NS(O)NSCClF
Эупарен
(CH)NS(O)NH
Метаболит эупарена
Химически чистый эупарен представляет собой белые кристаллы с температурой плавления 105-107 °С. Хорошо растворяется в ацетоне, хлороформе, бензоле. Растворимость в метаноле 1,5%. Значительно хуже растворяется в петролейном эфире и гексане (не более 0,2%). В воде практически нерастворим (0,001-0,0015%).
Химически чистый метаболит - желтоватые кристаллы с температурой плавления 87-89 °С. Хорошо растворяется в метаноле, ацетоне, хлороформе. Растворимость в бензоле 13,6%. Значительно хуже растворяется в петролейном эфире и гексане (не более 0,1-0,2%). В воде практически нерастворим (0,0015-0,002%).
Принцип метода
. Метод* основан на экстракции эупарена и его метаболита из пробы бензолом, очистке экстракта путем вымораживания восков и хроматографии в тонком слое силикагеля КСК. Зоны локализации препаратов на пластинке обнаруживают путем перевода эупарена и его метаболита в бензолдиазониевую соль, которую проявляют 
-нафтиламином. Метод позволяет определять 3 мкг эупарена и 1 мкг метаболита в пробе. Чувствительность метода для воды и пищевых продуктов 0,06 мг/кг и 0,02 мг/л соответственно.
________________
* М.А.Клисенко, Л.В.Сорокина, А.И.Товстенко (ВНИИГИНТОКС).
Реактивы и растворы
Ацетон х.ч.
Бензол х.ч.
Диметилформамид х.ч.
Кальций сернокислый х.ч.
Кислота соляная х.ч. плотностью 1,19 г/см
и 4 н. раствор соляной кислоты.
Кислота серная плотностью 1,84 и 25%-ный раствор серной кислоты.
Кальций хлористый ч.
Метанол х.ч.
Натрий азотистокислый х.ч.
Натрий хлористый х.ч.
-Нафтиламин х.ч.
Проявляющий реактив, 1 г -нафтиламина растворяют в смеси 30 мл диаметилформамида* с 20 мл ацетона. Перед опрыскиванием смешивают этот раствор с 4 н. соляной кислотой (1:1).
_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
Силикагель КСК.
Стандартный ацетоновый раствор эупарена х.ч. (100 мкг/мл).
Стандартный ацетоновый раствор метаболита х.ч. (100 мкг/мл).
Получение эупарена и его метаболита
Эупарен . 50-100 г 50%-ного смачивающегося порошка препарата размешивают в 100-200 мл бензола, ацетона или хлороформа. Экстракт фильтруют через складчатый фильтр и упаривают досуха на водяной бане. К сухому остатку при постоянном помешивании и подогревании на водяной бане порциями по 15-20 мл добавляют метанол. После того как осадок полностью растворится, метанольный раствор охлаждают при комнатной температуре. Выпавшие белые кристаллы эупарена отфильтровывают, сушат и используют для приготовления стандартного раствора.
Метаболит эупарена . N', N'-диметил-N-фенил-сернокислый диамид получают из химически чистого эупарена путем щелочного гидролиза. Для этого к 10-20 г эупарена приливают 50-100 мл метанола и осторожно прибавляют насыщенный раствор едкого натра (100-200 мл). После полного растворения осадка смесь нагревают с обратным холодильником 2 ч на кипящей водяной бане. Метанол отгоняют. Содержимое колбы после удаления метанола охлаждают и подкисляют соляной кислотой до кислой реакции (рН 2-4). Выпавший белый осадок, который частично содержит метаболит эупарена, отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают хлороформом тремя порциями по 20 мл. Хлороформ сливают в отдельную колбу, в которую сливают и хлороформ (3 раза по 30-60 мл) после экстракции в делительной воронке метаболита из фильтрата. Хлороформные экстракты высушивают 20-40 г безводного сернокислого натрия, переносят в сухую колбу и на водяной бане упаривают досуха.
Сухой остаток метаболита перекристаллизовывают из бензола так же, как перекристаллизовывают эупарен из метанола (бензол добавляют порциями не более 5 мл).
Приборы и посуда
Баня водяная.
Водоструйный насос или аспиратор для создания вакуума при отгонке растворителя.
Воронки Бюхнера.
Воронки химические.
Делительные воронки на 200-250 мл.
Камера хроматографическая.
Колбы мерные на 100 мл.
Капиллярные пипетки.
Мельница для размола силикагеля.
Микропипетки.
Прибор для отгонки растворителей с набором грушевидных колб вместимостью 50-150 мл.
Пульверизаторы стеклянные.
Сито капроновое 100 меш.
Ступка с пестиком.
Стеклянные пластинки 12х12 см.
Фильтровальная бумага.
Цилиндры мерные.
Шоттовские воронки N 2 или 1.
Приготовление пластинок
14 г измельченного и просеянного через сито 100 меш силикагеля смешивают в ступке с 1 г просушенного и просеянного сернокислого кальция, добавляют 40 мл воды и 15 мин тщательно размешивают пестиком в ступке. Суспензию равномерно наносят на шесть пластинок. Сушат пластинки при комнатной температуре 17-18 ч, активируют путем нагревания в сушильном шкафу при 100-110 °С в течение 15-20 мин. Хранят пластинки в эксикаторе над слоем осушителя (серная кислота или хлористый кальций).
Ход анализа . Вода, виноградный сок, вино. Пробу объемом 50 мл вносят в делительную воронку и трижды в течение 1,5-2 мин экстрагируют бензолом (50, 25 и 25 мл). Экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (10-15 г) в колбу для отгонки растворителя и упаривают под вакуумом при температуре бани не выше 60 °С.
Виноград . 50 г ягод винограда вносят в коническую колбу, разминают стеклянной палочкой и заливают 50 мл бензола. После встряхивания в течение 3-4 мин экстракт фильтруют через слой безводного сернокислого натрия (10-15 г) в колбу для отгонки растворителей. Экстракцию повторяют бензолом 2 раза порциями по 25 мл. Объединенный экстракт упаривают под вакуумом при температуре бани не выше 60 °С.
Внутренние органы животных . Не более 10 г внутренних органов тщательно растирают в фарфоровой ступке стеклянным пестиком и экстрагируют бензолом (3 раза по 25 мл). Экстракт переносят в прибор для отгонки растворителя и упаривают до сухого остатка.
Вымораживание восков (жиров) . К сухому остатку прибавляют 5 мл ацетона, стеклянной палочкой со стенок счищают нерастворившиеся воски (жиры). Колбу слегка подогревают, добавляют в нее 2,5 мл воды, ставят колбу на 30-40 мин в охлаждающую смесь (одна часть поваренной соли и 5 частей снега или льда). Параллельно с пробой охлаждают смесь, 5 мл ацетона с 2,5 мл воды. Выпавшие в осадок воски (жиры) отфильтровывают при просасывании через 2-3 слоя фильтровальной бумаги, вложенной в воронки Шотта N 2 или 1. Осадок на фильтре промывают охлажденной смесью ацетона с водой.
Фильтрат переносят в делительную воронку и добавляют в нее 25 мл хлороформа (хлороформом предварительно ополаскивают колбу из-под фильтрата). Экстракция продолжается 2-5 мин. После отстаивания нижний (ацетоново-хлороформный) слой сливают через воронку с сернокислым натрием (5-10 г) в колбу для отгонки растворителя. Верхний (водный) слой дважды промывают хлороформом, который сливают в ту же колбу для отгонки растворителя. Хлороформ отгоняют под вакуумом на водяной бане с температурой не выше 60 °С.
Хроматографирование . Содержимое колбы после отгонки хлороформа или бензола растворяют в 0,2 мл ацетона и капиллярной пипеткой наносят на левую сторону пластинки. Операцию повторяют 3-4 раза, нанося раствор в центр первого пятна так, чтобы диаметр его не превышал 1 см. Пластинку поворачивают в горизонтальной плоскости на 90° и ставят в хроматографическую камеру с четыреххлористым углеродом для отделения примесей. После подъема растворителя до края пластинки ее вынимают и сушат 10 мин на воздухе под вытяжкой, затем 1,5-2 мин в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С.
На высушенную пластинку справа от пробы наносят стандарт эупарена и метаболита (в одну точку). Пластинку помещают в хроматографическую камеру с системой растворителей (смесь бензола с метанолом 50:1) перпендикулярно первому направлению фронта растворителя. После подъема растворителей на 10 см пластинку вынимают и сушат 10 мин под вытяжкой, затем в сушильном шкафу 1,5-2 мин при 100-105 °С. Опрыскивают пластинку 25%-ной серной кислотой и ставят в сушильный шкаф с температурой 100-110 °С на 10-15 мин. Пластинку переносят на 5 мин в эксикатор, насыщенный парами окислов азота, которые получают путем добавления к насыпанному на дно эксикатора азотистокислому натрию (5-10 г) соляной кислоты (5-10 мл).
Пластинку вынимают из эксикатора и оставляют на воздухе на 10-15 мин до полного удаления паров окислов азота. После опрыскивания хроматограмм раствором -нафтиламина на белом фоне проявляются ярко-малиновые пятна с 
0,85-0,9 (эупарен) и 0,4-0,45 (метаболит).
Количественное определение препаратов осуществляют путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен пробы и стандартов.
Расчет. Содержание препаратов в пробе рассчитывают по формуле:
,
где 
- количество эупарена (метаболита) в пробе, мг/кг или мг/л;
- количество эупарена или метаболита, найденное на хроматограмме, мкг;
- масса или объем анализируемого продукта, г или мл.
Примечание. Если проба содержит большое количество эупарена и его метаболита (более 0,2 мг/кг или более 0,2 мг/л), для анализа берут аликвотную часть (1/10, 1/20) бензольного экстракта и, минуя стадию хроматографирования в четыреххлористом углероде, используют систему бензол - метанол (50:1).