Методические рекомендации по определению формальдегида в биосредах

     ПРИНЦИП МЕТОДА

Метод основан на взаимодействии формальдегида с димедоном, экстракции продукта взаимодействия (формальдимедона) органическим растворителем из водного дистиллата, полученного после соответствующей обработки крови и мочи, последующем хроматографировании его на пластинках "Silufol" или силикагель-крахмал.

Открываемый минимум на пластинке - 0,05 мкг формальдегида.

Чувствительность: в крови - 0,25 мкг/мл, в моче - 0,6 мкг/мл (учитывая естественный фон формальдегида в этих средах, который может колебаться в значительных пределах).

Зависимость "окраска и размер пятен" наблюдается в интервале 0,05-1,0 мкг формальдегида в пробе, что соответствует 0,5-10 мкг формальдимедона на пластинке.

Схема реакции получения формальдимедона

     РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ

     ПОЛУЧЕНИЕ ФОРМАДИМЕДОНА

К 10 мл 30%-ного водного раствора формальдегида (0,1 г/моля) при перемешивании прибавляют 100 мл спиртового раствора димедона (31 г - 0,22 г/моля димедона в 100 мл этилового спирта). Полученную смесь нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 35-40 минут. Нагревание убирают и оставляют охлаждаться на воздухе до 20-25 °С. Выпавший осадок формальдимедона отфильтровывают на воронке Бюхнера, или на воронке с пористым фильтром, промывают дистиллированной водой (2 раза по 10 мл) и сушат на воздухе в чашке Петри.

С целью получения дополнительного количества формальдимедона следует упарить спиртовый фильтрат до начала выпадения кристаллического осадка, охладить до комнатной температуры и отфильтровать выпавшие кристаллы формальдимедона.

Полученный осадок формальдимедона перекристаллизовывают. Для этого в коническую колбочку помещают 10-15 мл диметилформамида, нагревают до 100 °С и постепенно прибавляют осадок формальдимедона. Полученную смесь нагревают до кипения. При наличии нерастворившегося осадка прибавляют несколько миллилитров диметилформамида до полного растворения осадка. Полученный раствор охлаждают на воздухе до 20-25 °С. Выпавший осадок формальдимедона отсасывают на воронке Бюхнера и промывают этиловым спиртом 2 раза по 5 мл. Осадок сушат на воздухе до постоянного веса.

Т.пл. - 184-186 °С. При отсутствии диметилформамида осадок формальдимедона можно перекристаллизовать из этилового спирта.

     ОБОРУДОВАНИЕ И ПОСУДА

     ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

     1. Определение формальдегида в крови

Для получения плазмы крови добавляют 0,1%-ный раствор гепарина или 5%-ный раствор цитрата натрия в 0,85% растворе NaCl.

Центрифугированием отделяют плазму.

К 2 мл полученной плазмы прибавляют 2 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков, центрифугируют 15 минут (число оборотов 2000 об/мин), декантируют верхний слой. К полученному раствору прибавляют 2 мл дистиллированной воды и из полученной смеси отгоняют с водяным паром 2 мл дистиллата. К отгону прибавляют 1 мл спиртового раствора димедона (концентрации 200 мкг/мл), нагревают 10 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником, охлаждают и экстрагируют хлороформом.

Для экстракции продукта реакции (формальдимедона) берут 2 мл хлороформа и встряхивают в делительной воронке в течение 5 минут. Экстракцию повторяют еще раз. Хлороформенные экстракты объединяют, пропускают через фильтр с безводным сульфатом натрия и упаривают в грушевидной колбе на водяной бане до объема 0,1-0,2 мл.     

ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЕ

Содержимое колбы после отгонки растворителя при помощи градуированной пипетки наносят на хроматографическую пластинку. Проба наносится в одну точку на середину пластинки на расстоянии 1,5 см от ее нижнего края. Нанесение проводится таким образом, чтобы диаметр полученного пятна не превышал 1 см. Справа и слева от пробы на расстоянии не менее 1 см наносят растворы "свидетелей" - стандартные растворы определяемого препарата. Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру для хроматографирования, в которую наливают растворитель - хлороформ. Высота слоя растворителя на дне камеры не должна превышать 0,5 см. После подъема растворителя пластинку вынимают из камеры и отмечают линию, до которой поднялся растворитель, сушат на воздухе до полного исчезновения запаха хлороформа.

Для обнаружения препарата пластинку опрыскивают 0,5% раствором йода в хлороформе.

Формальдимедон обнаруживается на пластинках в виде желтых пятен на белом фоне. Количественное определение препарата производится путем визуального сравнения размера и интенсивности окраски пятен определяемого вещества в пробе с интенсивностью и размером пятен стандартов.

Идентификацию препарата осуществляют по величине пятен, равное 0,48±0,02.

Формула для расчета:     

,

где - содержание формальдегида, мкг/мл;

- количество формальдимедона, найденное в анализируемой пробе, мкг;

- объем исследуемой пробы, мл;

9,7 - фактор пересчета от формальдимедона к формальдегиду.

     2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИДА В МОЧЕ

К 0,5 мл мочи прибавляют 3,5 мл дистиллированной воды и 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. Из полученной смеси отгоняют 2 мл с водяным паром. К отгону прибавляют 1 мл спиртового раствора димедона (концентрации 200 мкг/мл) и дальше поступают, как описано выше.