Методические указания по определению дифоса (аббата) в продуктах животного происхождения методом тонкослойной хроматографии (дополнение к N 1350-75)

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении препарата из тканей животного ацетоном, осаждении коэкстрактивных веществ из водно-ацетонового раствора уксуснокислым свинцом на холоду, последующем переэкстрагировании дифоса в гексан, хроматографировании на пластинках "силуфол" в двух системах растворителей: Н-гексан-ацетон и диэтиловый эфир-Н-гексан. Для проявления хроматограмм применяют раствор бромфенолового синего и азотнокислого серебра с последующей обработкой лимонной кислотой. Количественное определение проводят путем визуального сравнения интенсивности окраски и размера пятен препарата из анализируемых проб стандартных растворов.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

- Диапазон определения концентраций 0,2-25 мкг дифоса в анализируемой пробе;

- Предел обнаружения - 0,2 мкг или 0,02-0,05 мг/кг (мг/л);

- Размах варьирования - 70-90%;

- Среднее значение определения стандартных количеств дифоса - 79,8%;

- Стандартное отклонение - 4,8;

- Относительное стандартное отклонение - 0,06;

- Доверительный интервал среднего при =0,95 и =10-79,8%.

2.4.1. Приготовление 20% водного раствора уксуснокислого свинца. 20 г уксуснокислого свинца растворяют в 80 мл дистиллированной воды. При использовании основного уксуснокислого свинца 20 г его растворяют при легком подогревании в 80 мл 5% уксусной кислоты и рН раствора доводят едким натрием до 5,4-5,6. Хранят в закрытой посуде.

2.4.2. Приготовление 10% водного раствора уксусной кислоты.

2.4.3. Приготовление проявляющего реактива.

Реактив 1,25 мг бромфенолового синего растворяют в 5 мл ацетона и объем доводят до 50 мл 0,25% раствором азотнокислого серебра (0,125 г азотнокислого серебра растворяют в 15 мл дистиллированной воды и добавляют 35 мл ацетона). Хранят в закрытой посуде из темного стекла при температуре 4-6 °С в течение месяца.

Реактив 2,2% раствор лимонной кислоты. 2 г лимонной кислоты растворяют в 98 мл дистиллированной воды. Хранят в закрытой посуде при температуре 4-6 °С в течение 5-6 дней.

2.4.4. Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденных Заместителем Главного Государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 за N 2051-79.

2.5.1. Экстракция и очистка экстрактов.

Навеску мяса, печени, почек, легких, сердца по 10 г, жира 2-3 г измельчают ножницами и помещают в колбу с притертой пробкой, молока берут 10 мл. Пробы заливают 30 мл ацетона, тщательно перемешивают и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 80 мин. Ацетоновый экстракт фильтруют в чистую колбу через воронку с ватным фильтром. Пробы промывают 10 мл ацетона и пропускают через тот же фильтр. К объединенному ацетоновому экстракту приливают 20 мл дистиллированной воды. 2 мл раствора уксуснокислого свинца и помещают в испаритель холодильника на 1 час. (Экстракты жира лучше оставлять в испарителе холодильника на ночь). После этого содержимое переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют на протяжении 3-5 мин при частоте вращения 3000 мин. Надосадочную жидкость сливают в чистую делительную воронку. (Если на поверхности экстракта имеются взвешенные частицы, его дополнительно фильтруют через воронку с ватным фильтром). В делительную воронку добавляют 10 мл 10% уксусной кислоты и 60 мл дистиллированной воды. Дифос реэкстрагируют из этой смеси трижды Н-гексаном, используя каждый раз по 10 мл экстракта. При плохом разделении слоев, в связи с образованием эмульсии, добавляют 5 мл насыщенного раствора натрия сернокислого. Объединенные гексановые экстракты сушат над натрием сернокислым безводным в течение 10-15 мин. Упаривание экстракта проводят в вытяжном шкафу при комнатной температуре до объема 0,2-0,3 мл.

2.5.2. Хроматографирование.

Сконцентрированный гексановый экстракт наносят на пластинку "силуфола" на расстоянии 1,5 см от нижнего края и 3,5 см от правого вертикального края. Диаметр нанесенного пятна не должен превышать 0,5 см.

Для выявления дифоса используют двухмерную хроматографию. Сначала пластинку помещают в хроматографическую камеру горизонтально (на левый край), куда налита смесь ацетона с гексаном (1:5). После того, как фронт растворителей пройдет всю пластинку, её подсушивают на воздухе и данную процедуру повторяют ещё дважды.

Слева от нанесенной пробы наносят на пластинку стандартный раствор дифоса. Пластинку помещают в вертикальном положении в камеру со смесью растворителей эфир-Н-гексан (1:2). Общий объем подвижных растворителей в камере подбирают таким образом, чтобы хроматографические пластинки погружались на 0,4-0,5 см. После того, как фронт растворителей поднимется на высоту 10 см от старта, пластинку вынимают и сушат на воздухе.

2.5.3. Проявление.

После испарения растворителей пластинку опрыскивают бромфеноловым синим с азотнокислым серебром и помещают на 5 мин в сушильный шкаф при температуре 30 °С. Затем пластинку опрыскивают раствором лимонной кислоты. Дифос проявляется в виде синих пятен на лимонно-желтом фоне. На обработку одной пластинки расходуют по 3-5 мл проявляющих реактивов. Величина составляет 0,32.