Инструкция по микробиологическому и технохимическому контролю дрожжевого производства

Рис.1. Кислотообразующие бактерии мелассы: лейконосток мезентериодидес (Leuconostok mesenteridides):

- форма клеток (контрастная окраска с опаль-блау); - колонии на сусле-агаре с мелом

На агаризованной дрожжевой воде с 4% сахарозы эти же бактерии образуют слизистые бесцветные колонии, в глубине среды чечевицеобразные. Под микроскопом - это довольно мелкие (1,3-1,5 мкм) диплококки и цепочки - стрептококки, по Граму окрашиваются положительно.

Агглютинирующие бактерии. При посеве на агар-сусло с мелом вырастают колонии кислотообразующих бактерий, но более мелкие и с более слабой зоной просветления (диаметр 0,4-0,3 мм); под микроскопом видны цепочки клеток - стрептококки, похожие на кислотообразующие бактерии, по Граму окрашиваются положительно.

Чтобы определить, действительно ли это агглютинирующие бактерии, производят следующее ее определение. В 2-3 мл взвеси, приготовленной из 0,1 г прессованных дрожжей и 10 мл водопроводной воды, петлей вносят бактериальный материал, взятый из колонии. Пробирку несколько раз встряхивают. Наличие склеивания дрожжевых клеток в хлопья указывает на то, что это колонии агглютинирующих бактерий.

Другой быстрый способ проверки заключается в том, что на предметное стекло наносят пипеткой каплю взвеси дрожжей, приготовленную вышеизложенным способом, вносят на петле бактериальный материал, взятый из колонии, и смешивают прямо на стекле этой же петлей. Образование хлопьев свидетельствует о том, что это колонии агглютинирующих бактерий.

Более длительный способ проверки заключается в предварительной разводке бактерий из выросшей колонии. Для этого прокаленной петлей с соблюдением всех правил асептики материал из колонии переносят в пробирку с жидким солодовым суслом с дробиной и 2% мела. Засеянную пробирку помещают в термостат при температуре 30 °С и выдерживают ее там 24 ч. Из полученной разводки бактерий отбирают 1 мл и смешивают с 5-10 мл дрожжевой взвеси, приготовленной вышеописанным способом. Образование хлопьев при встряхивании указывает на агглютинирующие свойства разводки.

Плесени. Колонии на поверхности агаровой среды растут быстро, образуются пушистые дернинки разного цвета - серые, зеленоватые, черные с желтым краем, белые. Под микроскопом видны длинные нити с перегородками или без перегородок и большое количество разной формы (круглых, продолговатых, изогнутых) клеточек - колоний или спор. По морфологии конидий и способам их образования определяют различные роды плесневых грибов.

Кокковая микрофлора. Колонии на поверхности питательных сред мелкие, круглые, желтые или беловатые, слегка морщинистые или гладкие.

Методы окраски микроорганизмов

Простая окраска. Материал, взятый петлей из колонии, вносят в каплю воды на предметном стекле, высушивают и фиксируют в пламени горелки. Подготовленный препарат заливают 1-2 каплями краски (метиленовой синью по Леффлеру или фуксином по Пфейферу - способ приготовления см. приложение II), выдерживают в течение 0,5-1 мин и смывают дистиллированной водой.

Окраска по Граму. Препарат готовят так же, как и для простой окраски: высушивают, фиксируют и заливают карболовым раствором генцианвиолета, выдерживают 2 мин при легком подогревании над пламенем горелки, следят, чтобы краска при этом не подсыхала. Затем избыток краски сливают, заливают препарат раствором йода в йодистом калии и выдерживают в течение 1-2 мин. Далее сливают раствор и быстро опускают препарат в 90%-ный этиловый спирт, выдерживают несколько секунд до тех пор, пока не перестанут отходить струйки краски. После этого препарат промывают водой и заливают фуксином, приготовленным по Пфейферу, на 0,5-1 мин, смывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают с иммерсионной системой. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Вычисление процентного соотношения микроорганизмов

На плотных агаровых средах в чашках Петри вырастают колонии различных микроорганизмов, соотношение которых выражают в процентах к общему количеству микроорганизмов. При этом учитывают только те чашки, в которых выросло не более 200, но и не менее 30 колоний. Например, если при посеве выросло всего 130 колоний, из них 30 - спорообразующие бактерии, то количество этих бактерий по отношению к общему количеству микроорганизмов составит 30%.

Для получения данных для расчета на поверхности агара-сусла с мелом подсчитывают общее количество всех выросших колоний, а затем отдельно количество колоний спорообразующих, кислотообразующих, кокков, дрожжей и определяют процентное содержание их по отношению к общему количеству колоний.

Пример. Выросло 60 колоний спорообразующих бактерий, 50 колоний дрожжей, 40 колоний кислотообразующих (в том числе и агглютинирующих бактерий), 10 колоний кокков. Всего 160 колоний. В процентах к общему количеству это составит: спорообразующих бактерий 38, дрожжей 31, кислотообразующих бактерий 25 и кокков 6.

Содержание гнилостных бактерий в мелассе и процентное отношение их к общему количеству микроорганизмов определяют путем подсчета колоний в зонах просветления на молочном агаре.

Пример. Общее количество колоний в 1 г мелассы 15 тыс., из них гнилостных - 50, что составит 0,33% к общему количеству.

В результате полученных при микробиологическом анализе данных производится оценка качества мелассы и ее пригодности для переработки в производстве. Так, при наличии в 1 г мелассы не более 2 тыс. микроорганизмов она считается хорошей, от 2 до 20 тыс. - посредственной, свыше 20 тыс. - плохой. Однако большое число (около 90%) спорообразующих бактерий даже в хорошей по обсемененности мелассе из-за возможного присутствия нитритообразующих бактерий дает основание считать ее трудной для переработки, а при наличии дрожжей - опасной при производстве маточных и засевных дрожжей. Кроме того, такая меласса плохо хранится.

Биологическая проба на наличие нитритообразующих бактерий

Мелассу, обсемененную микроорганизмами, быстро образующими нитриты из нитратов (которые всегда содержатся в мелассе), трудно перерабатывать в дрожжевом производстве. Нитриты в количестве 0,001% в среде тормозят рост и почкование дрожжей, а в количестве 0,004% почкование прекращается полностью.

Мелассу разбавляют стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10 в стерильной пробирке и ставят в термостат при температуре 30 °С. Качественную пробу на наличие нитритов в пробирке производят через 12, 16, 24, 36 и 48 ч.

По скорости образования нитритов в мелассе, разбавленной водой в соотношении 1:10, т.е. по скорости размножения нитритообразующих бактерий, судят о степени пригодности ее для дрожжевого производства. При появлении через 12-16 ч в пробе с реактивом Грисса даже слабо-розового окрашивания следует принять меры, подавляющие рост бактерий, или уничтожить их, применяя высокотемпературный режим при осветлении, а также антисептики.

Качественная проба на наличие нитритов в питательной среде

В чистую сухую пробирку наливают 0,5 мл первого раствора Грисса и 0,5 мл второго раствора Грисса, нагревают на кипящей водяной бане в течение 1-2 мин и прибавляют 0,2-0,3 мл (по каплям) испытуемого мелассового раствора. Покраснение смеси указывает на наличие нитритов в среде. По интенсивности окрашивания судят о количестве нитритов.

Можно пользоваться сухим реактивом Грисса, предварительно разведенным дистиллированной водой в соотношении 1:10.

Выявление наличия нитритообразующих бактерий в кислых мелассах

Этот метод разработан Харьковским отделением ВНИИХПа. На дрожжевые заводы довольно часто поступают кислые мелассы, рН которых составляет 5,2-6,0. Известно, что при таком рН тормозится скорость роста нитритообразующих бактерий, для большинства кислых меласс вышеописанные условия биологической пробы не являются оптимальными и реакция с реактивом Грисса носит отрицательный характер, что приводит к неправильной оценке мелассы по наличию нитритообразующих бактерий. Для этого предварительно следует довести рН мелассового раствора до 7,0-7,2 и только потом выдерживать его в термостате при 30 °С.

С этой целью в отдельной пробе мелассы устанавливают количество щелочи (NaOH), необходимое для доведения раствора мелассы до рН 7,0-7,5. Для этого в небольшой стаканчик отвешивают на технохимических весах 1 г мелассы, добавляют 10 мл стерильной водопроводной воды, размешивают стеклянной палочкой и приливают по 0,1 мл 0,1 н. раствора NaOH (каждый раз замеряя рН), пока в растворе мелассы величина рН не достигнет 7,0-7,5. Проверку рН ведут с помощью потенциометра или с индикаторной бумагой "Рифан".

Затем в стерильную пробирку снова отвешивают 1 г мелассы, добавляют 10 мл дистиллированной водопроводной воды и установленное ранее количество 0,1 н., раствора NaOH для доведения рН до 7,0-7,5; пробирку закрывают ватной пробкой и помещают в термостат при температуре 30 °C.

За скоростью образования нитритов следят, как обычно, при помощи реактива Грисса, отбирая пробы спустя 12, 16, 24 ч и более.

Определение количества нитритов, образовавшихся в мелассе

Этот метод разработан Харьковским отделением ВНИИХПа. Методы определения нитритов (KNO, NaNO) основываются на образовании с нитритами азотных красителей, для чего рекомендуется ряд реактивов. Наиболее распространенным из них является смесь нафтиламина и сульфаниловой кислоты - реактив Грисса, принятый и для качественной реакции определения нитритов.

Содержание нитритов определяют по интенсивности образующейся при этом розовой окраски сопоставлением оптической плотности испытуемого раствора с оптической плотностью стандартного раствора азотистокислого натрия (NaNO) на фотоэлектроколориметре (ФЭК) или визуально.

Так как собственная окраска мелассы в случае незначительных концентраций нитрита может снизить точность определения, следует предварительно осветлить мелассу. Для этой цели рекомендуется обработка раствора активным углем.

Расчет количества нитритов ведется на содержание NO в граммах или микрограммах (1 г =1000000 мкг) в 100 г мелассы, 1 г NaNO соответствует 0,667 г NO.

Количественное определение накопившихся в пробе мелассы нитритов производят после получения положительной реакции с реактивом Грисса в биологической пробе, принятой для установления нитритообразующих бактерий. Слабо-розовая окраска свидетельствует о том, что в пробе содержится мало нитритов, красная - о том, что много. Оценка мелассы сводится к установлению активности нитритообразования по количеству нитритов, образующихся в биологической пробе.

Методика анализа заключается в следующем. В 2 стерильные конические колбочки вместимостью по 100 мл отвешивают по 5 г мелассы, добавляют в каждую колбочку по 50 мл стерильной водопроводной воды, закрывают ватными пробками, тщательно размешивают и помещают в термостат при температуре 30 °С. Спустя 14-16 ч через каждые 2 ч качественной пробой проверяют появление нитритов, отбирая по 2-3 капли в пробирку с реактивом Грисса.

При оценке интенсивности окраски "мало" 1-ю колбочку берут на количественный анализ, а 2-ю оставляют в термостате.

В отобранную коническую колбочку с мелассой добавляют 2-2,5 г активного угля, тщательно взбалтывают, выдерживают 5-10 мин, количественно переводят содержимое в мерную колбочку вместимостью 100 мл, доводят водой до метки, взбалтывают и фильтруют через складчатый фильтр.

Если спустя 2 ч после взятия на анализ 1-й колбочки интенсивность окраски с реактивом Грисса во 2-й колбочке оценивается уже как "много" нитритов, ее вынимают из термостата и обрабатывают так же, как и 1-ю. При отсутствии интенсивной окраски колбочку с мелассой оставляют еще на 2 ч.

Определение количества нитритов фотоэлектроколориметром (ФЭК). Из 1-й колбочки (качественная оценка "мало") отбирают 5 мл фильтрата (после обработки углем) в мерную колбочку вместимостью 50 мл, добавляют 35 мл дистиллированной воды (до объема 40 мл), 8 мл свежеприготовленного реактива Грисса, доводят объем до метки водой и взбалтывают. Через 15 мин определяют на ФЭК оптическую плотность окрашенного раствора.

Из 2-й колбочки (качественная проба на нитриты "много") отбирают 20 мл фильтрата (после обработки углем) и вносят в мерную колбочку вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, взбалтывают и на определение отбирают 5 или 1 мл в мерную колбу на 50 мл, доводят водой до 40 мл (т.е. добавляют воды соответственно 35 или 39 мл), вводят 8 мл реактива Грисса и доводят водой до метки, взбалтывают и спустя 15 мин определяют на ФЭК оптическую плотность окрашенного раствора. Построение калибровочной кривой для этого метода не рекомендовано.

Вместо этого одновременно в трех мерных колбочках на 50 мл готовят стандартный раствор, отбирая в 1-ю колбочку 10, во 2-ю 20 и в 3-ю 30 мл второго стандартного раствора азотнокислого натрия, т.е. по 10, 20, 30 мкг NO. Во все колбочки добавляют воды до объема 40 мл (т.е. 30, 20, 10 мл воды) и по 8 мл реактива Грисса, доводят до метки, взбалтывают и спустя 15 мин устанавливают оптическую плотность стандартных растворов на ФЭК.

Расчет количества нитритов в мелассе ведется следующим образом. В первую очередь устанавливают, какому количеству NO (в мкг) соответствует найденная оптическая плотность раствора мелассы. Например, если оптическая плотность стандартного раствора с 10 мкг NO соответствует 0,09, а найденная оптическая плотность исследуемого раствора мелассы 0,12, то после пересчета это составит 0,12·10/0,09=13,3 мкг NO. Расчет количества нитритов в мелассе в 1-й колбочке (оценка "мало" нитритов) ведется по формуле

,

где - содержание NO в мелассе, %; - количество NO, найденное в 5 мл фильтрата по оптической плотности исследуемого и стандартного растворов, мкг; - количество осветленного углем фильтрата, взятое для определения оптической плотности раствора, мл; - навеска мелассы, взятая на определение, г; 100 - пересчет на 100 мл фильтрата после осветления мелассы углем; 100 - пересчет на 100 г мелассы; 1000000 - перевод микрограммов в граммы.

Пример пересчета. Взято 5 г мелассы и после накопления нитритов, обработки углем и доведения объема до 100 мл на определение отобрано 5 мл фильтрата в мерную колбочку на 50 мл.

Допустим, что оптическая плотность исследуемого раствора 0,124; оптическая плотность стандартного раствора с 20 мкг NO 0,148. Отсюда , т.е. количество NO, найденное в 5 мл фильтрата, составит

; ; .

Общее количество нитритов, накопившихся в пробе мелассы, составит =16,75·100·100/5·5·1000000=/2500=16,75/2500 =0,0067%.

Расчет количества нитритов в 3-й колбочке (оценка "много") ведется по формуле

,

где - содержание NO, в мелассе, %; - количество NO, найденное в 5 мл фильтрата по оптической плотности исследуемого и стандартного растворов, мкг; - количество раствора, взятое из 2-й мерной колбочки на определение, мл; - количество осветленного фильтрата мелассы для второго разведения, мл; - навеска мелассы, взятая на анализ, г; 100 - пересчет на 100 мл осветленного фильтрата, на 100 мл при втором разведении и на 100 г мелассы; 1000000 - перевод микрограммов в граммы.

Пример расчета. Взято 5 г мелассы и после накопления нитритов и обработки углем доведено до 100 мл, 20 мл фильтрата отобрано во 2-ю мерную колбочку и доведено до 100 мл, откуда на определение нитритов отобрано 5 мл в мерную колбочку на 50 мл.

Допустим, что оптическая плотность этого раствора составляет 0,177, оптическая плотность стандартного раствора с 30 мкг NO равна 0,193, откуда: =0,177х30/0,193=27,5 мкг NO; =5; =20; =5.

Общее количество нитритов, накопившееся в пробе мелассы, составляет: 27,5·100·100·100/5·20·5·1000000=/500=27,5/500=0,055% NO.

Если нитритов образовалось "очень много" и на определение из 2-й колбочки взят всего 1 мл, то расчет ведется по формуле .

Определение количества накопившихся в пробе мелассы нитритов  визуальным способом. При определении нитритов в пробе мелассы визуальным способом количество NO устанавливают таким образом. Подбирают ряд пробирок одинакового диаметра. В 4 из них набирают 1, 2, 3, 4 мл второго стандартного раствора NaNO, в 1 мл которого содержится 1 мкг NO. К 1-й пробирке добавляют 3,2 мл, ко 2-й - 2,2, к 3-й - 1,2 и к 4-й 0,2 мл дистиллированной воды так, чтобы в каждой пробирке находилось 4,2 мл.

В две другие пробирки* отбирают 1-2 мл испытуемого осветленного раствора мелассы, добавляют в обе пробирки воды до общего объема 4,2 мл и во все 6 пробирок добавляют по 0,8 мл раствора Грисса до общего объема 5 мл. Содержимое пробирки взбалтывают и спустя 15 мин устанавливают, с какой пробиркой стандартного ряда совпадает окраска испытуемого раствора мелассы.

________________

* В две пробирки испытуемый раствор отбирают для большей точности анализа. При расчете берут среднее трех определений.

При визуальном способе определения нитритов не следует доводить окраску раствора до интенсивного розового цвета, правильнее соответственно уменьшить взятое на анализ количество испытуемой среды.

Расчет количества NO в пробе мелассы ведут следующим образом. Допустим, что при оценке количества нитритов "мало" из колбочки вместимостью 100 мл после осветления мелассы в две пробирки отобрано по 1 мл испытуемого раствора, к которому добавлено 3,2 мл воды и 0,8 мл раствора Грисса. Спустя 15 мин установлено, что окраска этого раствора совпадает с 4-й пробиркой стандартного раствора NaNO, т.е. в ней найдено 4 мкг NO.

Отсюда в 100 г мелассы может накопиться: 4·100·100/1·5·1000000=4/500=0,008% NO, т.е. общая формула расчета составляет =/500%, где а - найденное количество NO во взятом на определение 1 мл раствора мелассы, мкг; 500 - разведение и перевод микрограммов в граммы.

Если в 2 пробирки отобрано не по 1 мл, а, например, по 2 мл испытуемого раствора, а окраска раствора тоже совпала с 4-й пробиркой стандартного раствора, что соответствует 4 мкг NO, тогда в 100 г мелассы содержится 4·100·100/2·5·1000000=4/1000=0,004% NO.

Общая формула расчета в этом случае будет =/1000%.

Если оценка количества нитритов, накопившихся при биологической пробе, характеризовалась как "много", то на определение из 2-й колбочки вместимостью 100 мл после осветления мелассы отбирают всего 0,5 мл в пробирку.

Допустим, что розовая окраска этого раствора совпала с окраской 2-й пробирки стандартного раствора NaNO, что соответствует 3 мкг NO, тогда найденное количество нитритов составит 2·100·100·100/0,5·20·5·1000000=2/50=0,040% NO.

Общая формула расчета при таком разведении будет =/50, где - количество NO в пересчете на 100 г мелассы; - количество NO в 0,5 мл раствора, мкг; 50 - разведение и перевод микрограммов в граммы.

Рис.2. Микрогазометр:

1 - стаканчик; 2 - манометрическая крышка; 3 - измерительная трубка; 4 - газоотводная трубка; 5 - трехходовой кран

Перед началом работы в манометрическую крышку заливают насыщенный раствор поваренной соли, подкрашенный метиленовой синью. Раствор наливают до основания измерительной трубки и этот уровень считают за нуль; все шлифы смазывают вазелином. Измерительную трубку градуируют с точностью до 1 мл.

Высоту 1 мл на измерительной трубке вычисляют по следующей формуле:

,

где - диаметр измерительной трубки (=8 мм); =3,14.

Подставив эти значения в формулу, получим 1000·4/3,14·64=20 мм.

Ход определения заключается в следующем. Отобранные для анализа 0,5 г дрожжей помещают в стаканчик прибора, заливают 10 мл водопроводной воды температурой 35 °С и размешивают их в этой воде. К полученной суспензии дрожжей добавляют 10 мл 10%-ного раствора сахара (сахарозы, глюкозы или мальтозы) и быстро закрывают стаканчик манометрической крышкой, предварительно переведя трехходовой кран в положение , затем в положение для выравнивания давления (см. рис.2) внутри прибора с атмосферным. После этого кран переводят в положение и прибор помещают в термостат при 35 °С, отметив время начала анализа. Наблюдают за ходом брожения и отмечают время, когда солевой раствор в измерительной трубке поднимется до отметки 10 мл, т.е. время, за которое выделилось 10 мл СО.

После окончания анализа кран на газоотводной трубке переводят в положение для того, чтобы жидкость в трубке опустилась, и разъединяют манометрическую трубку и стаканчик. Из стаканчика выливают жидкость, моют и вытирают досуха.

У различных культур, используемых в производстве, зимазная активность колеблется от 40 до 60 мин, мальтазная - от 70-80 до 160 мин.

Определение генеративной активности дрожжей

Показатель генеративной активности дает возможность объективно судить о степени пригодности той или иной культуры дрожжей для производства. Генеративная активность - это способность дрожжей к активному росту и размножению. Описанным ниже методом определяется скорость роста дрожжей в определенных условиях -  модуль роста.

Ход определения заключается в следующем. 0,1 г дрожжей в прессованном виде, предварительно выращенных на агаризованной среде, помещают в колбочку вместимостью 300 мл. Добавляют 70 мл мелассы плотностью 8% СВ, осветленной горячим способом, и 0,04 г однозамещенного фосфорнокислого калия, хорошо перемешивают до образования равномерной взвеси и ставят на 6 ч в качалочный аппарат, помещенный в термостат с температурой 30-32 °С.

Количество засевных и выросших дрожжей определяют на приборе ФЭК-56 по оптической плотности или мутности раствора. Перед определением на приборе взвесь дрожжей разбавляют водой. 3 мл взвеси дрожжей помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки водопроводной водой и определяют после тщательного перемешивания оптическую плотность взвеси.

Фотоэлектрический колориметр-нефелометр ФЭК-56 предназначен как для измерения оптической плотности, или светопропускания растворов, так и для измерения светорассеяния взвесей и эмульсий в проходящем свете, т.е., по существу, измеряется тоже оптическая плотность.

В инструкции, приложенной к прибору, описаны принцип действия, устройство прибора (с рисунками и фото), подробно описана методика работы с ним, поэтому эти сведения в данной Инструкции не приведены.

Для определения количества дрожжей во взвеси по оптической плотности пользуются светофильтром N 3, кюветами - 5,0; 6,0 мм (толщина кюветы).

Разбавленную указанным выше способом взвесь дрожжей наливают в одну кювету, а в другую кювету для сравнения наливают раствор мелассы, приготовленный следующим способом: 3 мл раствора мелассы с содержанием 8% СВ помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водопроводной водой и перемешивают.

Оптическую плотность взвеси дрожжей определяют в начале и конце выращивания, полученные значения сравнивают с градуировочной таблицей или кривой и таким образом получают данные о количестве дрожжей во взвеси. Принципы изготовления градуировочных таблиц приведены ниже.

Генеративная активность культуры оценивается по количеству дрожжей, накопившихся за период выращивания (6 ч).

Основным показателем является скорость роста дрожжей - модуль роста. Модуль роста определяют по формуле, предложенной Е.А.Плевако,

,

где - скорость или модуль роста; - количество засеянных дрожжей, г; - количество выросших дрожжей, г; - длительность выращивания, ч.

У дрожжей с хорошей генеративной активностью модуль роста составляет от 0,20 до 0,23, со средней - соответственно от 0,16 до 0,19, с плохой - от 0,12 до 0,15.

В табл.1 приведена примерная градуировочная таблица для определения концентрации дрожжей во взвеси.

Таблица 1

1-2 капли среды с дрожжами из аппарата или комочек прессованных дрожжей переносят пастеровской пипеткой или предварительно прокаленной петлей в 10 мл стерильной водопроводной воды, хорошо перемешивают, это первое разведение.

Из первого разведения 1-2 капли переносят во вторую пробирку со стерильной водопроводной водой и опять хорошо перемешивают - второе разведение.

Из второго разведения 2-3 капли взвеси пипеткой наносят на поверхность агаровой среды (сусло-агар с мелом) и распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского. Затем шпатель переносят на поверхность питательной среды во вторую чашку Петри и тщательно размазывают по ее поверхности оставшийся на шпателе посевной материал. Такой метод истощающего посева позволяет получить либо на первой, либо на второй чашке количество колоний, удобное для подсчета, т.е. не более 30-40.

Чашки с посевами ставят в термостат при 30 °С крышкой вниз и выдерживают там в течение 48 ч, после чего подсчитывают выросшие колонии дрожжей и бактерий. Подсчитывают отдельно колонии основной культуры (сахаромицетов), посторонних дрожжевых грибков и бактерий и вычисляют процентное соотношение их.

Внешний вид колоний всех этих микроорганизмов различен: сахаромицеты образуют колонии белого или слегка желтоватого цвета, выпуклые, с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем; посторонние грибки (несахаромицеты) образуют колонии, различные по внешнему виду в зависимости от рода и вида этих грибков: плоские или слегка выпуклые, сероватого цвета или белые, с поверхностью слегка складчатой или матовой, ворсинчатой, с ровным, фестончатым или ворсинчатым краем; из бактерий чаще всего присутствуют кислотообразующие бактерии (лейконосток, агглютинирующие бактерии), спорообразующие бактерии и кокковые формы (сарцины или педиококки).

Кислотообразующие и агглютинирующие бактерии образуют колонии, по внешнему виду похожие между собой: круглые, полупрозрачные, слегка опалесцирующие, просветляющие мел и образующие различной интенсивности и ширины зону просветления вокруг своих колоний, диаметр колоний от 0,5 до 1 мм.

Спорообразующие бактерии образуют довольно крупные колонии диаметром 3-10 мм, сухие или слизистые, с ровным или фестончатым краем. Педиококки или сарцины образуют желтые, реже белые, складчатые или гладкие колонии разного размера.

Пример расчета для засевных дрожжей. На всей поверхности чашки выросло 49 колоний дрожжей-сахаромицетов, одна колония посторонних дрожжей (всего 50) и две колонии кислотообразующих бактерий (колоний с зоной просветления, всего 52).

Количество посторонних дрожжей определяют следующим образом:

посторонних дрожжей.

Количество бактерий в процентах вычисляют по отношению к общему количеству микроорганизмов. Например, в данном случае общее количество составляет 52, отсюда количество кислотообразующих бактерий составит

.

Таким образом, при содержании посторонних дрожжей выше допустимого такие дрожжи ЧК не могут быть использованы для изготовления ЕЧК, а должны быть использованы только как засевные для товарных аппаратов.

Определение степени зараженности посторонними микроорганизмами содержимого дрожжерастильных аппаратов и дрожжей ЧК и ЕЧК. Этот метод разработан Ленинградским отделением ВНИИХПа для определения абсолютного количества клеток различных групп и видов вредной микрофлоры как в процессе производства, так и в дрожжах ЧК и ЕЧК, т.е. в 1 мл культуральной среды, дрожжевого концентрата или в 1 г дрожжей.

Дрожжевому производству свойственна определенная, характерная для него посторонняя микрофлора, которую условно можно подразделить на следующие физиологические группы: молочнокислые (кислотообразующие и агглютинирующие) бактерии; гнилостные бактерии (большинство спорообразующих и часть не образующих споры); бактерии кишечной группы; посторонние дрожжи.

Для выявления этих групп микроорганизмов используют питательные среды определенного состава, а именно такие, на которых данный вид микробов имеет преимущественное развитие и может быть отличим по виду колоний от других микроорганизмов. Например, для обнаружения всех видов бактерий в питательные среды вносят антибиотик нистатин, обладающий губительным действием на дрожжи (фунгицидным). Этот препарат нужен для того, чтобы на чашках Петри не вырастали дрожжи, а колонии бактерий становились хорошо заметными.

Ниже приведены питательные среды для выявления приведенных выше групп микроорганизмов.

Для выявления и количественного учета производится посев исследуемого материала на приведенные выше среды. На дрожжевом агаре с сахарозой и нистатином вырастает большая часть инфицирующих бактерий, поэтому на этой среде подсчитывается общее количество бактерий в пробе в пересчете на единицу объема или массы. На этой же среде отдельно учитывается лейконосток; он образует характерные прозрачные каплевидные колонии.

На молочном агаре с нистатином выявляются гнилостные бактерии, вокруг их колоний образуются прозрачные зоны в результате расщепления белка молока.

Общая численность остальных бактерий может быть определена по разности между общим количеством бактерий, выросших на дрожжевом агаре с сахарозой, и количеством молочнокислых и гнилостных бактерий, выросших соответственно на сусле-агаре с мелом и молочном агаре.

Техника выполнения количественного посева состоит в следующем. Для обеспечения достаточной точности анализа необходимо определенный объем (1-10 мл) или массу (1 г) исследуемого материала развести стерильной водопроводной водой до такой степени, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 20-100 клеток посторонних микроорганизмов. При посеве 1 мл такой суспензии в чашку Петри из каждой клетки разовьется колония, и по числу выросших колоний можно подсчитать число клеток в исходном материале.

Так как трудно предугадать, во сколько раз следует развести водой пробу, чтобы в 1 мл суспензии оказалось от 20 до 100 клеток посторонних микроорганизмов, проводят несколько последовательных разведений одной и той же пробы и из них производят посев. После выращивания в термостате при 30 °С отбирают для анализа и подсчета те чашки, где разведение соответствует требуемому, т.е. в чашке вырастает 20-100 (не более 300) колоний. Число выросших колоний умножают на степень разведения пробы и вычисляют количество клеток в 1 г дрожжей (учитывая, что одна клетка образует одну колонию).

Например, на чашке Петри выросло 50 колоний молочнокислых бактерий, посев в эту чашку проведен из разведения дрожжей 1:100 тыс., значит, число молочнокислых бактерий в 1 г дрожжей равно 50·100 тыс. = 5 млн. клеток. Посев, как правило, осуществляется в две параллельные чашки, и для расчета берутся средние данные.

Техника последовательных разведений в стерильном стеклянном стаканчике (с бумажным колпачком) состоит в следующем. Отвешивают 1 г прессованных дрожжей или отбирают 1 мл бродящей жидкости из аппарата. В стаканчик наливают небольшое количество стерильной водопроводной воды из колбы со 100 мл этой воды. Дрожжи тщательно размешивают и растирают стерильной стеклянной палочкой, чтобы получилась однородная суспензия. Всю суспензию дрожжей из стаканчика возвращают в ту же колбу со 100 мл воды. Всю операцию проводят с соблюдением правил асептики (над пламенем горелки). Далее из колбы производят ряд последовательных разведений в стерильной воде, где с каждым последующим переносом разведение суспензии увеличивается в 10 раз. Рекомендуется при каждом новом переносе пользоваться новой, неиспользованной стерильной пипеткой.

При анализах дрожжей ЧК, ЕЧК и содержимого аппаратов рекомендуются следующие схемы посевов для обнаружения и подсчета посторонних микроорганизмов (табл.2).

Таблица 2

После разведения проб производят посев в чашки Петри на указанные агаризованные среды. В стерильную чашку Петри вносят 1 мл суспензии из соответствующего разведения, указанного в табл.2. Далее в чашки, предназначенные для выявления бактерий (сусло-агар с мелом, дрожжевой агар, молочный агар), отдельной стерильной пипеткой со слегка отбитым носиком вносят водную суспензию нистатина. Затем в пробирки с расплавленным суслом-агаром, предназначенные для выявления молочнокислых бактерий, вносят стерильный порошок мела в количестве 0,2-0,3 г (стерилизуют отдельно в пробирках при 170 °С 1 ч). Тщательно перемешивают, выливают в чашки, куда был внесен нистатин, и снова тщательно перемешивают с посевным материалом и нистатином (вращательным движением). В остальные чашки выливают дрожжевой агар, молочный агар и тщательно смешивают с посевным материалом и нистатином. После застывания агаровой среды чашки ставят в термостат крышкой вниз для выращивания при температуре 30 °С на 24-48 ч. Все операции по внесению в чашки отдельных ингредиентов производятся с соблюдением правил асептики в непосредственной близости от пламени горелки.

Через 24 ч после выдерживания в термостате подсчитывают колонии лейконостока на дрожжевом агаре с сахарозой. При этом нужно не пропустить момента, когда колонии имеют вид отдельных капель, позже колонии сливаются вместе, и их невозможно учесть. Через 48-72 ч подсчитывают количество гнилостных бактерий, так как к этому времени ясно обозначаются зоны просветления среды вокруг этих колоний на молочном агаре.

В результате подсчета количество бактерий выражают числом клеток (сотни, тысячи, миллионы, миллиарды) в 1 г прессованных дрожжей. Посторонние дрожжи выражают в процентах от общего количества дрожжей.

     
Зарубежные методы выявления посторонней, вредной для производства микрофлоры

Выявление бактериальной зараженности. Определение общего количества бактерий. Пробу бродящей жидкости из промежуточных стадий разводят стерильным 0,5%-ным физиологическим раствором в соотношении 1:10, 1:100 и 1:1000 и соответственно производят посевы внутрь питательной среды по 1 мл из перечисленных разведений. (Для подавления роста дрожжей применяют питательную среду с добавлением актидиона - см. приложение II.) Число колоний в чашках должно быть не менее 30 и не более 300.

Пробу прессованных дрожжей разводят физиологическим раствором в соотношении 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000 и соответственно проводят посевы. Из этих разведений вносят по 1 мл внутрь среды и по 0,1 мл на поверхность среды с актидионом.

Выросшие колонии подсчитывают сначала невооруженным глазом, затем с лупой или при помощи микроскопа со слабым увеличением (60-80 раз).

Выявление бактерий, вредных для производственного процесса и готовой продукции. Для выявления спорообразующих бактерий пробу, разведенную в соотношениях 1:10 и 1:100, выдерживают перед посевом 30 мин в водяной бане при 80 °C.

Выявление бактерий, протеолизирующих и вызывающих гидролиз крахмала. Производят посев из всех разведений на агаризованную среду с крахмалом и желатиновую среду (основой служит дрожжевая вода) по 0,1 мл на поверхность питательных сред. Посевной материал распределяют по поверхности среды при помощи шпателя Дригальского. Выращивание посевов на желатиновой среде ведут при комнатной температуре 48-72 ч, на среде с крахмалом - при температуре 30 °С в термостате 48-72 ч.

Колонии протеолизирующих бактерий разжижают желатину и слегка углубляются в среду; колонии гидролизующих крахмал бактерий образуют зону просветления.

Выявление клостридий сульфовосстановителей. Присутствие этих бактерий в дрожжах опасно, так как они разлагают сернистые соединения дрожжей с образованием сероводорода. Для того чтобы их обнаружить, производят посев на специальную среду (см. приложение II).

Пробу дрожжей разбавляют 1:10 физиологическим раствором и пастеризуют 10 мин при 80 °С, охлаждают и производят посев в питательную среду. Посевной материал вносят в три пробирки со средой во все убывающем количестве: в 1-ю пробирку 5 мл суспензии дрожжей; во 2-ю - 3 мл суспензии + 2 мл физиологического раствора; в 3-ю пробирку 2 мл суспензии + 3 мл физиологического раствора.

Среду и посевной материал тщательно перемешивают и добавляют в каждую по 1 мл стерилизованного парафинового масла. Все пробирки помещают в термостате при 37 °С на 48 ч.

В случае наличия сульфатредуцирующих бактерий в пробирках появляются линзообразные колонии, окруженные черной зоной.

Посев в элективную среду*. Одну каплю пробы из аппарата или одну петлю из середины кусочка прессованных дрожжей или из концентрата в воде вносят с соблюдением правил асептики в накопительную (элективную) ацетатную среду. Пробирку с посевом помещают в термостат при 30 °С и наблюдают в течение 5 сут за появлением мути или пленки на поверхности среды.

________________

* Метод используется для выявления очень незначительного количества клеток посторонних дрожжей, иногда не обнаруживаемых при высеве на чашке Петри.

Чем раньше появится пленка на поверхности среды, тем более инфицированным посторонними дрожжами является материал. Этот метод позволяет дать оценку степени зараженности посторонними дрожжами анализируемой пробы.

Если пленка появилась через 5 или большее число дней или совсем не появилась, это значит, что в исследуемом материале очень мало посторонних дрожжевых грибков или же их нет совсем. Если же пленка появилась через 3-4 дня, то дрожжи ЧК или ЕЧК можно считать удовлетворительными, пригодными для работы по удлиненным схемам. Появление пленки через 1-2 дня свидетельствует о том, что исследуемый материал содержит значительное количество посторонних дрожжей, дрожжи ЧК и ЕЧК неудовлетворительные и непригодные для работы по удлиненным схемам.

Контроль ферментативной активности дрожжей ЧК и ЕЧК

В оценку ферментативной активности входит определение подъемной силы, зимазной и мальтазной активности.

Определение подъемной силы методом всплывания шарика теста. Подъемная сила должна составлять 35-45 мин при определении ее по методике, описанной в действующем ГОСТе на дрожжи хлебопекарные.

На технических весах отвешивают навеску испытуемых дрожжей в количестве 0,31 г. К навеске добавляют 4,8 мл 2,5%-ного раствора поваренной соли, нагретого до 35 °С, и тщательно размешивают пестиком в фарфоровой ступке или чашке. К полученной дрожжевой эмульсии добавляют от 6,5 до 7,5 г (в зависимости от влажности) муки 85%-ного помола и быстро замешивают тесто, придавая ему форму шарика, который не должен прилипать к рукам.

Шарик опускают в стакан с водой температурой 35 °С и ставят в термостат при температуре 35 °С, заметив время, когда был опущен шарик в воду, и наблюдают за шариком до тех пор, пока он не всплывет к поверхности воды. Время всплывания шарика отмечают. Промежуток времени между опусканием шарика в воду и его всплыванием должен быть не более 8-10 мин у хороших дрожжей. Это время следует умножить на коэффициент 3,5, полученный эмпирически, для перевода на количество минут, найденное стандартным методом определения подъемной силы.

Пример. Время всплывания шарика 10 мин. 10·3,5=35 мин при определении стандартным методом.

Определение зимазной и мальтазной активности. Показатели зимазной и мальтазной активности, являющиеся суммарными показателями работы ферментов дрожжей и муки, в отличие от подъемной силы означают активность только дрожжевых ферментов.

Зимазная и мальтазная активность выражается временем, необходимым для выделения 10 мл диоксида углерода при сбраживании 20 мл 5%-ного раствора сахара прессованными дрожжами, взятыми в количестве 2,5% к объему среды (подробно метод описан на с.16).

Зимазная активность качественных маточных и засевных дрожжей должна составлять 30-40 мин, мальтазная активность - не превышать 80-90 мин.

Оценка стойкости ферментных систем дрожжей при хранении

Маточные дрожжи используют на заводах обычно не сразу после выработки, а хранят в холодильных камерах в течение нескольких недель. Поэтому дрожжи должны обладать способностью сохранять свою ферментативную активность длительное время.

Для выявления устойчивости ферментных систем предложено три показателя: стойкость при хранении, осмочувствительность, генеративная активность.

Оценка стойкости по изменению подъемной силы. Подъемная сила хранящихся дрожжей определяется периодически (через 5-10 сут) по стандартному методу (см. с.119) или ускоренным методом по "шарику" (см. с.27).

Если ферментные системы дрожжей устойчивы, то подъемная сила в процессе хранения не изменяется или ухудшается очень незначительно - на 1-2 мин за 10 сут. Если дрожжи нестойкие, то подъемная сила заметно ухудшается - на 5-10 мин за 10 сут хранения.

Определение и оценка осмочувствительности. Это свойство дрожжей является также хорошим показателем устойчивости ферментов дрожжей. Оно проявляется в средах с повышенным осмотическим давлением и выражается в понижении бродильной активности дрожжей. Это понижение может быть различным: сравнительно небольшим и очень значительным. Так, осмочувствительность дрожжей, полученных по воздушно-приточному способу, может колебаться от 0 до 75 мин (по данным Уайта).

Уайт предложил методику определения осмочувствительности, по которой этот показатель выражается разницей во времени между подъемной силой дрожжей в тесте без соли и в тесте с повышенной концентрацией ее - до 3,35%. Чем больше разница во времени, тем более высокой осмочувствительностью обладают дрожжи. Хорошо хранящиеся дрожжи должны обладать слабой осмочувствительностью (от 1 до 10 мин). Подробно метод описан на с.35.

Определение генеративной активности. Маточные дрожжи должны обладать высокой генеративной активностью - способностью дрожжевых клеток давать большое количество дочерних клеток за определенный промежуток времени (метод описан на с. 29).

Рис.3. Проба из дрожжерастильного аппарата - правильно протекающий процесс: почкование правильное, примесь посторонних дрожжей незначительна

Рис.4. Проба из дрожжерастильного аппарата - неправильно протекающий процесс: клетки угнетены, почкование неправильное, значительная примесь посторонних дрожжей, есть отмершие клетки, окрашенные метиленовой синью

Определение количества отмерших клеток. Отмершие клетки появляются в среде дрожжерастильного аппарата при наличии в ней ядовитых веществ или при нарушениях температурного режима (повышение температуры) и при сдвигах рН в кислую сторону от оптимального диапазона (4,5-5,5).

Одну каплю среды из дрожжерастильного аппарата смешивают на предметном стекле с одной каплей разбавленной синьки (по Финку) (см. приложение II - краски) и через 1-2 мин просматривают препарат под микроскопом при увеличении в 600-800 раз. Отмершие клетки дрожжей окрасятся в синий цвет, так как клеточная оболочка и мембрана мертвых клеток не препятствуют проникновению краски. В живые клетки краска не проникает. При нормально протекающем процессе отмерших клеток не должно быть.

Рис.5. Счетная камера:

1 - большой квадрат; 2 - малый квадрат

Анализу подвергают жидкость, отходящую с сепараторов и прессов. Одну каплю этой жидкости помещают на середину камеры, где нанесена клетка, покрывают покровным стеклом (шлифованным) и притирают его до образования по краям стекла радужных Ньютоновых колец. Помещают на предметный столик микроскопа и считают клетки дрожжей при увеличении в 600-800 раз. Сначала определяют количество дрожжевых клеток в 1 мл исследуемой жидкости. Для пересчета необходимо знать, что каждый квадратный миллиметр поверхности дна камеры разделен на 25 больших квадратов и 400 малых, высота камеры, т.е. расстояние от дна камеры до нижней поверхности покровного стекла, составляет 0,1 мм. Отсюда объем одного маленького квадратика будет равен 1/4000 см, или 1/4000000 мм. Считают клетки дрожжей в 80 маленьких квадратиках или в 5 больших, что равнозначно.

Пример пересчета. В 80 малых квадратах или в 5 больших найдено 15 клеток: 15·4000000/80=7·500000 клеток в 1 мл жидкости, в пересчете на 1 л жидкости - 7,5 млрд., т.е. около 1 г дрожжей в пересчете на прессованные. Следует учесть, что в 1 г прессованных дрожжей содержится от 8 до 10 млрд. дрожжевых клеток в зависимости от их размеров.

Определяют объем жидкости и подсчитывают общее количество дрожжей в этом объеме в килограммах. На основании полученных данных находят величину потерь в процентах по отношению к общему выходу дрожжей из затора или за сутки. Для правильного учета потерь отбирают пробы при первой, второй и третьей сепарациях затора или из общего желоба для отходящей жидкости. Лучше всего учитывать потери дрожжей за каждые 8 ч путем анализа средней пробы, отбираемой автоматически.

При правильной работе сепараторов и прессов потери дрожжей в этой стадии не превышают 0,1% по отношению к количеству дрожжей, вырабатываемых заводом.

Группа микроор- ганизмов	Питательная среда	Разведение 1 г дрожжей
		100	1000	10 тыс.	100 тыс.	1 млн.	10 млн.	100 млн.
Культурные и посторонние дрожжи	Сусло-агар	-	-	-	-	-	2 чашки	2 чашки
Посторонние дрожжи	Сусло-агар	-	-	-	-	-	2 чашки	2 чашки
	Синтетическая среда с лизином	-	-	-	-	-	2 чашки	2 чашки
Бактерии и лейконосток	Дрожжевой агар с сахарозой и нистатином	-	-	-	2 чашки	2 чашки	2 чашки	-
Молочнокислые бактерии (лактобактерии с лейконостоком)	Сусло-агар с мелом и нистатином	-	-	-	2 чашки	2 чашки	2 чашки	-
Гнилостные бактерии	Молочный агар с нистатином	2 чашки	2 чашки	2 чашки	-	-	-	-

Молочнокислые бактерии	До 100 млн.
Лейконосток	До 1 млн.
Кишечная палочка	0
Гнилостные бактерии	5000
Дикие дрожжи	До 10%

Гриб	Подъемная сила, мин
Кандида гиллермондии	64-90
Кандида крузеи	74-160
Кандида брумптии	Не поднимает теста
Сахаромицеты (раса N 7)	18-20

Осмочувствительность, мин	Оценка дрожжей
От 1 до 10	Хорошая
От 10 до 20	Удовлетворительная
Более 20	Неудовлетворительная

Номер колбочки		1	2	3	4
Количество воды, мл		1,0	0,75	0,5	0,25

День наблюдения      и появления мути	1-й	2-й	3-й	4-й	5-й
Коэффициент мути	10	8	6	4	2

Номер колбы	Количество воды, мл	День, на которым наблюдалось помутнение	Коэф- фициент	Результат определения качества, воды, %
1	1	1-й	10	1·10=10
2	0,75	3-й	6	2·6=12
3	0,5	4-й	4	3·4=12
4	0,25	На 5-й день помутнения не обнаружено	0	4·0=0

Рис.6. Прибор для микробиологического анализа воздуха

Перед употреблением прибор стерилизуют в автоклаве. Трубки с пробкой завертывают в бумагу и стерилизуют при 50 кПа в течение 30 мин. В склянку наливают 300 мл водопроводной воды, закрывают ватной пробкой и стерилизуют при 100 кПа в течение 1 ч.

Перед анализом прибор собирают, как указано на рис.6. Подводящую трубку соединяют с воздуховодом (необходимо специальное устройство для забора воздуха), к отводящей присоединяют реометр и при помощи зажима 4 регулируют количество воздуха, проходящего через стерильную воду. Предполагается, что микроорганизмы, содержащиеся в воздухе, будут задержаны водой. В течение 10-5 мин через прибор пропускают 100-120 л воздуха. Далее производят посев воды внутрь агаризованной питательной среды (дрожжевая вода с 4% сахарозы или солодовое сусло плотностью 8% СВ). Вносят по 1 мл воды в 4-5 чашек Петри, смешивают со средой и выращивают при 30 °C в течение 36-48 ч. Выросшие колонии считают на всех чашках Петри и полученные результаты пересчитывают на 1 м воздуха.

Пример. В 5 чашках выросло 8 колоний, это значит, что в 5 мл содержится 8 микроорганизмов (во всем объеме воды в склянке 300 мг). Это составит 8·300/5=480 микроорганизмов в 200 л воздуха, пропущенного через воду, следовательно, в 1 м содержится 480·5=2400 микроорганизмов.

В типовой дрожжерастильный аппарат подается ежечасно до 6000 м воздуха, следовательно, 2400·6000=24400000 посторонних микроорганизмов вносится в дрожжерастильный аппарат ежечасно при слабой очистке воздуха.

Если воздух, вдуваемый в аппараты, хорошо очищается, то в нем не должно содержаться посторонних дрожжевых грибов, спор и конидий плесеней.

Рис.7. Калибровочная склянка для определения БПК в сточных водах

Склянки оставляют в термостате при температуре 20 °С на 5 сут или более. За счет органических веществ сточной воды развивается сообщество микроорганизмов, на что расходуется растворенный кислород.

Величина уменьшения кислорода в склянке, умноженная на степень разведения, дает численную величину БПК.

Необходимое разбавление подсчитывают ориентировочно по результатам определения бихроматной окисляемости (ХПК). Условно принимают, что биологическое потребление кислорода составляет 50% химического потребления кислорода, а так как в воде после инкубации при правильно взятом разбавлении должно остаться 8-10 мг/л кислорода, то величину ХПК делят на 4 или 5. Полученный результат показывает, во сколько раз надо разбавить анализируемую воду.

Пример. ХПК сточной воды составляет 6000 мг О/л. Для того чтобы получить в исследуемой воде 8-10 мг/л кислорода, необходимо следующее ее разбавление: 6000/5=1200. Округленно 1000.

Сточные воды дрожжевых заводов, как и все промышленные воды, как правило, содержат незначительное количество микроорганизмов, поэтому требуется искусственное заражение разбавляющей воды бактериальной культурой, адаптированной к утилизации исследуемых веществ.

Приготовление культуры микроорганизмов для заражения. Анализируемую сточную воду разбавляют водопроводной водой в 10-100 раз, прибавляют биогенные реактивы (см. ниже) и оставляют в сосуде, закрытом ватной пробкой, на 2-3 дня. Появление мути или пленки указывает на развитие микрофлоры (проверяют под микроскопом). Микрофлору переносят в пробу анализируемой сточной воды, разбавляют в 5-20 раз и после дальнейшего развития флоры отбирают 1 мл этой воды на 1 л разбавляющей.

Приготовление разбавляющей воды. Дистиллированную воду для приготовления разбавляющей воды насыщают кислородом путем отстаивания ее в течение суток в открытом виде при комнатной температуре. На 1 л такой дистиллированной воды добавляют растворы реактивов в последовательности, указанной ниже.

1. Сульфат аммония (NH)SO (500 мг/л) - 5 мл.

2. Сернокислый магний MgSО (50 мг/л) - 0,2 мл.

3. Сода (двууглекислый натр NaHCO) - 0,3 г.

4. Культура микроорганизмов для заражения (см. выше) - 1 мл.

5. Фосфатный буферный раствор, состоящий из Са(НРО) - 25 мг и KНРО - 250 мг в 1 л дистиллированной воды. Такой раствор добавляется в количестве 0,4 мл.

Разбавляющую воду приготовляют в день ее использования.

Ход определения заключается в следующем. В мерную колбу вместимостью 1 л наливают сифоном (чтобы в колбу не попали пузырьки воздуха) разбавляющую воду до половины колбы, прибавляют 1 мл исследуемой воды и снова доводят до метки разбавляющей водой. Закрыв колбу пробкой, тщательно перемешивают ее содержимое.

Разбавленную описанным способом сточную воду разливают для инкубации в пять калиброванных склянок вместимостью 150-200 мл, наполняя их доверху, и закрывают притертыми пробками так, чтобы не оставалось пузырьков воздуха. Затем эту же воду наливают в колпачки от склянок и, перевернув склянки вверх дном, вставляют их в колпачки, вытесняя из них воду так, чтобы не осталось пузырьков воздуха. Так же заполняют другие пять склянок разбавляющей водой. Каждой пробе анализируемой жидкости соответствует одна склянка с разбавляющей водой.

В одной из пяти склянок с анализируемой пробой и в одной из пяти склянок с разбавляющей водой сразу же определяют растворенный кислород. Все остальные склянки (8 шт.) помещают в термостат при 20 °С (±1°). Через 5, 10, 15, 20 сут от начала инкубации вынимают из термостата по одной склянке с анализируемой водой и по одной склянке с разбавляющей водой и определяют в них растворенный кислород и содержание нитритов.

Нитриты определяют (по Гриссу) в воде, налитой в колпачок склянки, который снимают так же, как надевали, т.е. перевернув склянку вверх дном. Если в пробе начался процесс нитрификации, что обнаруживается по появлению в воде нитритов концентрацией, превышающей 0,1 мг/л, то дальнейшее определение БПК не проводят. Если на пятые сутки появляются следы нитритов, то следующее определение проводят через 7-8 сут.

Химическое определение растворенного кислорода выполняют по методу Винклера. Этот метод основан на способности растворенного кислорода переводить марганец с валентностью +2 в марганец с валентностью +4, последний, реагируя с йодидом калия, выделяет из него свободный йод, который оттитровывается гипосульфитом натрия. Результат определения пересчитывают в эквиваленты кислорода и выражают в миллиграммах О на литр.

По истечении определенного инкубационного периода в анализируемой пробе сточной воды определяют растворенный кислород. В склянку с анализируемой водой прибавляют 1 мл раствора сульфата марганца (II) или хлорида марганца (II), погружая наполненную пипетку до дна склянки. Другой пипеткой прибавляют 1 мл раствора Винклера (гидроксид калия или натрия с йодидом калия), погружая кончик пипетки под уровень пробы в горлышко кислородной склянки.

Склянку осторожно закрывают так, чтобы под пробкой не образовывались пузырьки воздуха, и содержимое хорошо перемешивают, переворачивая склянку, до образования хлопьевидного осадка.

Прозрачный раствор над осадком сифонируют. К осадку в склянке по стенке приливают 5 мл разбавленной (1:4) серной кислоты и перемешивают. Содержимое склянки сливают в коническую колбу. Пробку и склянку ополаскивают несколько раз водой и все сливают в ту же коническую колбу, куда приливают 2 мл раствора йодида калия (15%), и содержимое вновь перемешивают. Через 5 мин выделившийся йод титруют 0,01 н. раствором гипосульфита натрия до светло-желтой окраски. Прибавляют раствор крахмала и продолжают титрование до обесцвечивания.

БПК разбавляющей воды вычисляют по формуле     

где , - объем 0,01 н. раствора гипосульфита натрия, израсходованный на титрование жидкости при определении в ней содержания кислорода соответственно до инкубации и после инкубации, мл; , - вместимость склянок, в которых проводилось определение кислорода соответственно до инкубации и после инкубации, мл; - объем реактивов (кроме кислоты), прибавленный в склянку при определении кислорода, мл; - поправочный коэффициент для приведения концентрации раствора гипосульфита натрия к точно 0,01 н.; 8 - эквивалент кислорода; 0,01 - нормальность раствора гипосульфита натрия.

БПК анализируемой воды вычисляют по формуле     

где - объем сточной воды, взятой для анализа и разбавленный затем в мерной колбе до 1 л, мл.

БПК стоков дрожжевого завода подвергается сильным колебаниям в течение суток. В среднем величина этого показателя колеблется от 1000 до 5000 мг О, тогда как на городские очистные сооружения принимаются стоки с БПК не выше 500 мг О/л.

Качество мелассы	Количество биотина
	мкг/г	мг/т
Хорошее	0,25-0,18	250-180
Среднее	0,15-0,08	150-80
Неудовлетворительное	0,05-0,03	50-30

Номер колбы	Навеска исследуемого вещества, г	Количество дрожжей, млн./мл	Количество биотина, мкг
			по стандартной шкале	в 1 г исследуемого материала
1	0,15	45,0	0,01	0,066
2	0,1	39,5	0,0075	0,075
3	0,05	23,0	0,0035	0,070
			Среднее	0,070

Растворы	Количество, мл
20%-ный раствор сахарозы	1
Раствор А	0,5
Раствор В	0,5
ZnSO	0,4
CuSО	0,1
Буферный раствор	0,1
Дистиллированная      вода стерильная	2,0

Витамины	Количество витаминов, добавленное в каждую пробирку
	мл				мкг
Аневрин В	0,1				2
Рибофлавин В	0,1				1
Никотиновая кислота	0,1				50
-Аминобензойная кислота	0,1				3
Пиридоксин В	0,1				10
Пантотенат кальция	0,1				5
Мезоинозитол	0,1				500
В восемь пробирок из девяти добавляют раствор чистого биотина в возрастающем количестве.
Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8
Количество биотина, мкг	0,001	0,003	0,005	0,0075	0,01	0,02	0,03	0,04

Номер колбы	Количество добавленного биотина, мкг	Количество выросших клеток в 1 мл среды, млн.
1	0,001	11,17
2	0,003	22,7
3	0,005	27,6
4	0,0075	40,0
5	0,01	45,0
6	0,02	47,0
7	0,03	47,0
8	0,04	47,0
9	Контроль без биотина	2-2,5

Показания нефелометра (оптическая плотность взвеси)	0,395	0,450	0,520	0,535	0,550	0,555	0,555	0,540
Количество биотина в среде, мкг	0,001	0,003	0,005	0,0075	0,01	0,02	0,02	0,04

Сухие вещества, %, не менее	74
Сахар (по прямой поляризации), %	От 46 до 50
Инвертный сахар, %, не более	2,0
Доброкачественность, %
не более	65
не менее	55
рН	6,5-8,5
Общий азот, %, не менее	1,4
Аминный азот, %, не менее	0,3
Зола (за вычетом кальция), %, не менее	7,0
Калий (KO), %, не менее	3,5
Кальций (СаО), %, не более	1,0
Биотин, мкг/кг	200
Цветность, мл 0,1 н. раствора йода на 100 мл 2%-ного раствора мелассы, не более	2,0
Сернистый ангидрид, %, не более	0,05
Летучие кислоты, %, не более	1,2

Рис.8. Лабораторный рефрактометр:

1 - корпус прибора; 2 - осветительная призма; 3 - измерительная призма; 4 - шкала; 5 - ручка для перевода нониуса поля; 6 - окуляр поля зрения; 7 - винт, укрепляющий положение зеркала; 8 - осветительное зеркало; 9 - секторный рычаг компенсатора; 10 - стойка; 11 - основание

На призмы направляют свет (при помощи зеркала 8 ). Окуляр 6 можно опускать и поднимать, так как он укреплен на рычаге, поворачивающемся вокруг оси. Поворотом головки окуляр 6 устанавливают на фокус, при этом с правой стороны поля зрения видна шкала с делениями от 0 до 95%, из них одна часть от 0 до 50% имеет деления по 0,2%, а другая от 50 до 95% - по 0,1%. С левой стороны расположена шкала показателей преломления от 1,3 до 1,54.

Показание рефрактометра устанавливают по пунктирной линии. Поднимая и опуская рычаг окуляра, наводят эту линию на границу раздела темного и светлого полей зрения и отмечают на шкалах соответствующие показания.

Содержание сухих веществ при помощи рефрактометра определяют при температуре 20 °С. Для этого призмы рефрактометра включены в специальную оправу, в которой циркулирует вода указанной температуры. Если при снятии показаний рефрактометра температура исследуемого раствора имела отклонение от стандартной (20 °С), то в полученное значение необходимо внести температурную поправку. Если температура при определении сухих веществ была ниже 20 °С, то величину поправки вычитают из найденного количества. Если температура при определении выше 20 °С, то величину поправки следует прибавить к найденному количеству сухих веществ (см. табл.1 приложения IV).

Для определения сухих веществ рефрактометром 2-3 капли мелассы, не разбавленной или разбавленной водой в соотношении 1:1, наносят на центральную часть нижней призмы рефрактометра при помощи оплавленной стеклянной палочки. Верхнюю призму отпускают и плотно прижимают к нижней неподвижной призме. Затем путем передвижения окуляра находят наиболее резкую границу между темной и светлой половиной поля зрения и отмечают по шкале процентное содержание сухих веществ.

Содержание сухих веществ в мелассе (разбавленной водой в соотношении 1:1), выраженное в процентах, равно удвоенному показанию рефрактометра.

Для проверки правильности показания прибора на призму наносят каплю чистой дистиллированной воды и наблюдают за показаниями рефрактометра. Если пунктирная линия или центр кружка отклоняются от нуля при повторных определениях более чем на 0,2 показания правой шкалы, то при помощи специального ключа устанавливают ее нулевое положение.

При применении рефрактометра содержание сухих веществ в мелассных растворах с разбавлением исходной мелассы 1:1 увеличивается на 3-5% по сравнению с тем же показателем, полученным при определении сухих веществ в той же мелассе сахарометром.

В случае отсутствия рефрактометра или его неисправности сухие вещества определяют при помощи сахарометра.

Определение содержания сухих веществ сахарометром. Определение производят в растворе мелассы, разбавленной водой в соотношении 1:1. На технических весах тарируют стакан со стеклянной палочкой и взвешивают в нем 100 г исследуемой мелассы. К массе мелассы добавляют 60-70 мл горячей дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Смесь охлаждают до 20 °С, доводят дистиллированной водой (20 °С) до двойной массы мелассы (200 г), снова перемешивают и определяют в растворе содержание сухих веществ сахарометром.

Если при определении температура раствора имела отклонение от стандартной (20 °С), то в полученное значение необходимо ввести температурную поправку (см. табл.2 приложения IV).

Содержание сухих веществ в мелассе, выраженное в процентах, равно удвоенному показанию сахарометра.

Определение состава сахаров

В контроле дрожжевого производства точное определение содержания сахаров имеет большое значение, так как по количеству сахара в сырье определяют выход дрожжей. При поступлении мелассы на завод производят полный анализ состава сахаров и определение суммы сбраживаемых сахаров.

Для количественного определения содержания сахаров в мелассе служат поляриметрические и химические методы. Прямая поляризация не отражает истинной сахаристости мелассы, и общее содержание сбраживаемых сахаров в ней определяют по прямой и инверсионной поляризации. Кроме того, инвертный сахар определяют химическим методом (по Офнеру).

Определение содержания сахарозы методом прямой поляризации. Поляриметрический метод определения сахарозы основан на способности углеводов вращать плоскость поляризации луча света, а также на свойстве органических веществ, в молекуле которых имеется асимметрический азот углерода, вращать плоскость поляризационного луча. Известно, что колебания обыкновенного светового луча происходят во всех плоскостях, перпендикулярных его направлению.

При прохождении обыкновенного луча света через некоторые кристаллы их решетки способны пропускать лучи только определенного направления колебания. По выходе из кристалла колебания луча будут происходить только в одной плоскости, такой луч называется поляризованным.

Ход определения заключается в следующем. Две с половиной навески мелассы (65 г) при помощи теплой дистиллированной воды переводят без потерь в колбу вместимостью 250 мл, где вместе с ополосками должно быть около 150 мл.

Полученный раствор охлаждают до 20 °С и осветляют раствором азотнокислого свинца (340 г в 1 л) и гидроокиси натрия (32 г в 1 л).

Осветлители сохраняются отдельно. На осветление раствора мелассы расходуется 30-50 мл каждого из растворов. Для лучшего осветления и большей точности результатов анализа осветляющие реактивы следует вводить по частям (в 4-6 приемов).

Процесс осветления осуществляется следующим образом. В колбу с раствором мелассы прибавляют 5-10 мл раствора азотнокислого свинца и через 15-20 с 5-10 мл раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают легким вращением колбы в течение 15-20 с. Затем опять в указанном порядке наливают осветлители. Так повторяют несколько раз в зависимости от полноты осветления. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой почти до метки, удаляют пену каплей эфира и доливают водой точно до метки при температуре 20 °С. Приставшие к шейке колбы капельки воды вытирают фильтровальной бумагой, после чего взбалтывают содержимое колбы и фильтруют через сухой бумажный фильтр, вставленный в сухую воронку, которую покрывают сверху часовым стеклом. Фильтрат собирают в сухую коническую колбу. Первые капли фильтрата выливают. Если фильтрат мутный, то его возвращают на фильтр до тех пор, пока не получится совершенно прозрачный раствор.

В целях удаления избытка свинца на каждые 100 мл полученного фильтрата в колбу прибавляют 0,3 г сухого измельченного порошка однозамещенного фосфата аммония (NННРО). Для его растворения жидкость энергично взбалтывают, после чего прибавляют на каждые 100 мл фильтрата по 0,2 г гидросульфита натрия (NaSO) или бисульфита натрия (NaHSO). Затем раствор перемешивают и оставляют на 20 мин, снова взбалтывают и фильтруют согласно предыдущим указаниям.

Полученный раствор является исходным для определения прямой и инверсионной поляризаций, а также инвертного сахара.

Осветленный раствор наливают в трубку высотой 200 мм и поляризуют в сахариметре при температуре 20 °С. Для каждой пробы проводят не менее трех отсчетов и принимают средний. Полученная величина и есть прямая поляризация раствора, обозначаемая буквой .

Поляриметрические исследования ведут при помощи поляриметров. В дрожжевом производстве в настоящее время получил широкое распространение поляриметр СУ-3. Ниже приведена его оптическая схема.

Оптическая схема прибора построена следующим образом (рис.9). Свет от электролампочки 1 проходит через матовое стекло 3 , предназначенное для рассеивания света (вместо матового стекла в оптическую систему может быть введен светофильтр 2 ). Далее световой поток проходит конденсорную линзу 4 , попадает на поляризатор 5 и выходит из него линейно-поляризованным. За поляризатором находятся два защитных стекла 6 и 7 , между которыми устанавливается поляриметрическая кювета с исследуемым раствором. Подвижной кварцевый клин 8 , стеклянный контрклин 9 и неподвижный кварцевый клин 10 образуют кварцевый компенсатор, который компенсирует вращение плоскости поляризации, вызванное исследуемым раствором. За кварцевым компенсатором установлен анализатор 11 , обнаруживающий поворот плоскости поляризации. Зрительная труба, состоящая из двухлинзового объектива 12 и окуляра 13 , сфокусирована на выходную грань поляризатора 5 . При помощи зрительной трубы наблюдают в увеличенном виде линию раздела поляризатора.

Рис. 9. Оптическая схема поляриметра СУ-3

Свет от электролампочки служит также для освещения шкалы 16 и нониуса 17 , что достигается при помощи отражательной призмы 14 и защитного стекла 15 , рассеивающего свет. Цифры и деления шкалы 16 и нониуса 17 рассматриваются в увеличенном виде при помощи лупы, состоящей из двух линз 18 .

Шкала связана с подвижным кварцевым клином. Таким образом, смещение подвижного кварцевого клина пропорционально углу вращения плоскости поляризации, вызванное исследуемым раствором, передается на шкалу и отсчитывается при помощи лупы.

Устройство прибора. Основными частями прибора (рис.10) являются узел измерительной головки 1 и осветительный узел 2 , соединенные между собой траверсой 3 , на которой укреплена камера 4 для поляриметрических трубок.

Рис.10. Общий вид поляризатора СУ-3

В передней части прибора имеется лупа 5 в оправе для отсчета показаний по шкале и зрительная труба 6 , в которой находится гильза 7 . С тыльной стороны измерительной головки находится узел нониуса. В нижней части измерительной головки расположена рукоятка кремальерной передачи 8 для перемещения подвижного кварцевого клина и связанной с ним шкалы.

Осветительный узел имеет поворотную обойму 9 со стеклянным светофильтром и матовым стеклом и патрон с лампочкой 10 .

Траверса крепится болтом к литому основанию 11 с вмонтированным внутрь его трансформатором, через который питается лампочка от сети переменного тока 220 В.

Калибровка шкалы поляриметра. Условную шкалу поляриметра калибруют по раствору химически чистой сахарозы. При поляризации раствора, содержащего точно 26 г сахарозы в 100 мл, в 200-миллиметровой трубке получают показание 100° условной шкалы. Таким образом, одно деление шкалы соответствует 0,26 г сахарозы. Шкала поляриметра при определении сахара показывает процентное содержание его. Для отсчета десятых долей предназначен нониус.

Перед началом работы необходимо установить прибор на нуль. При этом нулевое значение шкалы должно совпадать с нулем нониуса (рис.11,). После этого трубку заполняют исследуемым раствором, помещают в камеру прибора и производят отсчет показаний шкалы и нониуса. На рис.11, показано положение шкалы относительно нониуса, соответствующее отсчету +24,5°. При этом нуль нониуса расположен после 24 полных делений шкалы, а пятое деление нониуса совпало с одним из делений шкалы.

Рис.11. Отсчет показаний на шкале поляриметра

При анализе левовращающихся растворов все операции проводят в обратном направлении, в этом случае нуль нониуса расположен левее шкалы.

Поляризационная трубка длиной 200 мм считается нормальной. При поляризации в трубках длиной 100 или 400 мм показания поляриметра в первом случае удваивают, а во втором уменьшают в 2 раза.

Для трубок длиной 100 и 200 мм допускаются отклонения ±0,05 мм, для трубок длиной 400 мм - ±0,1 мм. Края трубок должны быть хорошо пришлифованы, а внутренняя поверхность - зеркально чистой. При наличии на ней налета, не удаляемого водой, необходимо промывать трубки слабым раствором уксусной кислоты, а затем водой. Поляризационную трубку закрывают с обоих концов хорошо пришлифованными и чистыми покровными стеклами и завинчивают гайками с эластичной резиновой прокладкой.

Трубку наполняют следующим образом. Один конец ее закрывают пришлифованным круглым стеклом и завинчивают гайкой. Затем, слегка наклонив трубку, заполняют ее испытуемым раствором так, чтобы жидкость выступала над краем трубки при вертикальном положении. Осторожно, срезая жидкость стеклом, закрывают и затем завинчивают трубку. В жидкости не должно оставаться пузырьков воздуха. Протерев стекла, производят поляризацию. Температура поляризуемого раствора должна быть равна 20 °С (в течение всего периода поляризации), поэтому поляриметр устанавливают в комнате, имеющей постоянную температуру 20 °С, или в футляре, входное отверстие которого завешивают шторой из черной ткани.

Прямую поляризацию осветленного раствора проводят в трубке длиной 200 мм при температуре 20 °С.

Для каждой пробы производят не менее трех отсчетов по поляриметру и принимают средний. Полученная величина и есть прямая поляризация раствора, обозначенная буквой .

Определение инверсионной поляризации. Для определения суммы сбраживаемых сахаров в мелассе производят инверсионную поляризацию, используя фильтрат, полученный для прямой поляризации.

Ход определения заключается в следующем. Отбирают 50 мл фильтрата (полученного для определения сахарозы по прямой поляризации), соответствующие 13 г мелассы, переводят их в колбу вместимостью 100 мл, приливают туда же 30 мл раствора соляной кислоты (одна часть соляной кислоты относительной плотности 1,19 и пять частей воды по объему), вращательным движением колбы перемешивают содержимое, опускают в раствор термометр и колбу помещают в водяную баню, предварительно нагретую до температуры 75 °С.

Колбу устанавливают не на дно бани, а на фарфоровую или металлическую вставку с круглыми вырезами.

Температуру воды в бане поддерживают в пределах 70-72 °С, нагревая жидкость в колбе в течение 2,5-3 мин до 67-69 °С и поддерживая эту температуру в течение 5 мин. После этого колбу из бани вынимают и быстро (не более 2,5 мин) охлаждают под краном до 20 °С. Весь процесс инверсии должен быть проведен в течение 10 мин.

После охлаждения раствора термометр вынимают и ополаскивают водой, доводят содержимое колбы до метки, тщательно взбалтывают, фильтруют и поляризуют в трубке длиной 200 мм точно при 20 °С. Удвоенное показание поляриметра дает инверсионную поляризацию, обозначаемую буквой . В случае отклонения температуры при поляризации раствора от 20 °С следует вносить поправку на температуру по формуле

,

где и - инверсионная и прямая поляризация, %;   - температура, °С.

Определение содержания инвертного сахара методом Офнера. Из осветленного раствора, оставшегося после определения прямой поляризации, отбирают пипеткой 10 мл (соответствующее 2,6 г мелассы), переводят в мерную колбу на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки. Отбирают пипеткой 25 мл разбавленного таким образом раствора (соответствующего 0,65 г мелассы), переводят в коническую колбу вместимостью 150 мл и прибавляют 25 мл реактива Офнера.

В смешанный раствор добавляют на кончике ножа немного талька в порошке или грубо измельченной пемзы. Колбу ставят на асбестовую сетку с вырезанными в центре отверстиями диаметром около 6,5 см и нагревают на газовой горелке или спиртовке в течение 4-5 мин до начала кипения, затем уменьшают пламя так, чтобы оно едва касалось сетки, и поддерживают умеренное кипение точно 7 мин, по истечении которых содержимое колбы охлаждают до 20 °С в холодной воде, не взбалтывая во избежание окисления осадка. При нагреве на электрической плитке кипение регулируют, включая и выключая плитку.

7,5 мл 1 н. раствора соляной кислоты, отмеренного градуированным цилиндром, осторожно прибавляют по стенкам колбы в охлажденный раствор, чтобы растворить находящийся на стенках осадок, и сразу же после добавления кислоты прибавляют к испытуемому раствору из бюретки 20 мл 0,0323 н. раствора йода.

Колбу закрывают стеклянной или корковой пробкой и оставляют на 2 мин, периодически перемешивая содержимое колбы вращением. Ровно через 2 мин оттитровывают избыток йода в колбе 0,0323 н. раствором гипосульфита. В конце титрования, когда раствор станет светло-желтым, в него добавляют 2,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и титруют до перехода окраски от синей в зеленую или бронзовую.

Одновременно проводят контрольный опыт (с тем же количеством раствора мелассы, реактивом йода, что и в основном опыте, но без кипячения) для установления поправки на окисляемость йодом веществ, находящихся в растворе.

По разности между количеством миллилитров гипосульфита, пошедшим на титрование в рабочем и контрольном опытах, устанавливают количество связавшегося йода. Содержание инвертного сахара определяют из расчета, что 1 мл 0,0323 н. раствора йода эквивалентен 1 мг инвертного сахара, по формуле

,

где - содержание инвертного сахара к массе мелассы, %; , - соответственно объем 0,0323 н. раствора серноватистокислого натрия в контрольном и рабочем опыте, мл; - навеска мелассы, г.

Пример. На определение инвертного сахара к 25 мл раствора, полученного разведением в 10 раз (10:100) раствора, подготовленного для поляризации (соответствующего 0,65 г мелассы), прибавили 20 мл 0,0323 н. раствора йода. На титрование избытка йода затратили 14,6 мл 0,0323 н. раствора гипосульфита. На то же количество йода в контрольном опыте израсходовали 19,4 мл гипосульфита. Следовательно, количество йода, вступившего в реакцию, будет равно 4,8 мл (19,4-14,6), т.е. в 0,65 г мелассы содержится 4,8 мг инвертного сахара, или в процентах к массе

%.

Расчет сахаристости (суммы сбраживаемых сахаров). Сахаристость рассчитывают по формуле

,

где - сахаристость мелассы, %; и - абсолютные значения прямой и инверсионной поляризаций, %; - содержание инвертного сахара, определенное химическим методом (по Офнеру).

Пример. %; %; °С; %.

%.

Для более полной оценки качества мелассы, поступившей на дрожжевые заводы, определяют содержание сахарозы и рафинозы в ней по формулам:

;

,

где и - содержание сахарозы и рафинозы в мелассе, %; и - абсолютные значения прямой и инверсионной поляризаций; - поправки на вращательную способность инвертного сахара , определяемого химическим методом.

Пример. %; %; °С; %.

%.

%.

     
Определение доброкачественности мелассы

Доброкачественность - это отношение сахара к общему количеству сухих веществ. Она рассчитывается по формуле

,

где - доброкачественность мелассы, %; - содержание сахара в мелассе, % по прямой поляризации (если сумма сбраживаемых сахаров превышает количество сахара, полученное по прямой поляризации, более чем на 1%, то содержание сахара в мелассе считают по сумме сбраживаемых сахаров); - содержание сухих веществ в мелассе, %.

Пример. =48%, =80%. Доброкачественность мелассы составит

%.

Доброкачественность мелассы, используемой в дрожжевом производстве, составляет 55-65%, т.е. на 100 массовых частей сухого вещества мелассы должно приходиться 55-65 массовых частей сахара. Хорошо перерабатывается меласса с невысокой доброкачественностью (58-60%).

При доброкачественности более 65% в мелассе имеется избыток сахара и недостаток несахаров, что препятствует активному размножению дрожжей. При доброкачественности ниже 55% в мелассе отмечаются, как правило, низкое содержание сахара (39-44%) и пониженная активная кислотность (рН 5-6,2). Такая меласса плохо хранится, и в ней могут протекать различные микробиологические и биохимические процессы.

Быстрый метод определения содержания мелассы в мелассных растворах при поступлении их в производство

Для быстрого учета сахара в мелассе используют пробы, взятые из сборников, куда поступает меласса после перемешивания (гомогенизации) с добавлением воды, например при разбавлении исходного сырья до плотности 35-17% СВ. При этом пользуются номограммами (рис.12, 13, 14).

Рис.12. Номограмма для определения количества мелассы (с содержанием сахара 46%) в 1 м раствора при содержании сухих веществ 17-24%

Рис.13. Номограмма для раствора мелассы, содержащей 23-28% сухих веществ

Рис.14. Номограмма для раствора мелассы, содержащей 27-36,5% сухих веществ

Для определения сахара в мелассных растворах требуется учитывать доброкачественность исходного сырья и концентрацию сухих веществ раствора мелассы по сахарометру в пробах, отобранных из сборника.

При помощи линейки соединяют две точки и , указанные на шкалах, и находят величину - количество мелассы (в кг) с содержанием 46% сахара в 1 м.

Определение активной кислотности (рН)

Активную кислотность (рН) мелассы определяют с помощью лабораторных рН-метров со стеклянными электродами. Для определения рН к навеске мелассы (20 г), взятой на технохимических весах, добавляют 20 г дистиллированной воды, тщательно перемешивают и определяют рН раствора обычно при помощи лабораторных рН-метров, строго соблюдая инструкцию по эксплуатации к лабораторному рН-метру. Показания рН-метра записывают по истечении 3 мин после погружения электродов. В настоящее время на дрожжевых заводах применяются лабораторные рН-метры ЛПУ-01 и рН-340.

Пределы измерения величины рН от 1 до 14 с диапазонами: 1-2; 2-5; 5-8; 8-11; 11-14. Погрешность прибора не превышает ±0,6% для диапазона измерения от 1 до 14 и от 0,04 до 0,05% для приведенных выше интервалов.

В приборе рН-340 предусмотрена автоматическая компенсация температуры исследуемого раствора и с помощью термометра.

Температурной компенсацией с помощью термометра рекомендуется пользоваться при измерении рН растворов, имеющих постоянную температуру. При этом ручку на лицевой панели с надписью "Температура раствора" следует установить на значение температуры исследуемого раствора. Для автоматической температурной компенсации применяется специальный термокомпенсатор, входящий в комплект датчика ДЛ-02.

Лабораторный датчик ДЛ-02 предназначен для крепления электродов и установки сосуда с исследуемым раствором при измерении рН. Датчик рассчитан на применение измерительных стеклянных электродов типа ЭСЛ и проточного хлорсеребряного электрода сравнения.

Все элементы датчика собраны на настольном вертикальном штативе, в верхней части которого установлен проточный, вспомогательный электрод сравнения.

Для измерения величины рН используется система со стеклянным и вспомогательным электродом, схема которой приведена на рис.15.

Рис.15. Схема измерения величины рН раствора с помощью рН-метра-милливольтметра рН-340

Сущность метода: при погружении стеклянного электрода 1 в исследуемый раствор между поверхностью шарика электрода и раствором происходит обмен ионами, в результате которого ионы лития в поверхностных слоях стекла замещаются ионами водорода и стеклянный электрод приобретает свойства водородного электрода.

Между поверхностью стекла и исследуемым раствором возникает разность потенциалов, величина которой определяется активностью ионов водорода в растворе.

Для создания электрической цепи при измерении применяются контактные электроды: внутренний контактный электрод 2 , заполняющий внутреннюю часть стеклянного электрода, и внешний контактный электрод 3 (вспомогательный), осуществляющий контакт с исследуемым раствором.

Вспомогательный хлорсеребряный электрод соединен с исследуемым раствором при помощи электролитического ключа 4 трубки, наполненной раствором хлористого калия, заканчивающейся пористой перегородкой 5 , через которую непрерывно просачивается раствор хлористого калия, предотвращая проникновение из исследуемого раствора в систему электрода 3 посторонних ионов, которые могли бы изменить величину электродвижущейся силы электрода.

Перед определением рН стеклянный электрод "вымачивают" в 0,1 н. растворе соляной кислоты в течение 8 ч, после чего электрод необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и удалить избыток воды фильтровальной бумагой.

Отсчет ведется по шкале 7 прибора 6 в зависимости от рН исследуемого раствора. Показания при диапазоне измерения от 1 до 14 снимают по нижней шкале через 1-3 мин после погружения электрода. При анализе раствора, рН которого находится в узких пределах, например 2-5, отсчет ведут по соответствующей шкале.

По окончании работы с прибором электроды следует оставить погруженными в воду. Для обеспечения правильной работы рН-метра необходимо периодически проводить проверку прибора по стандартным буферным растворам. Рекомендуется применять буферный раствор, рН которого находится в том же диапазоне измерения, что и рН исследуемых растворов.

Буферные растворы приготовляют из реактивов для рН-метрии. Эти реактивы выпускаются в виде фиксаналов. При эксплуатации прибора не следует допускать высыхания стеклянного электрода, так как это может привести к изменению его характеристик. Вспомогательный электрод необходимо периодически пополнять насыщенным при комнатной температуре раствором хлористого калия.

Определение содержания азота в мелассе

Азотные вещества мелассы в процессе выращивания дрожжей подвергаются изменениям с образованием новых соединений и в значительной мере определяют выход и качество готовой продукции.

Определение содержания общего азота. Общий азот в мелассе определяют по методу Кьельдаля, основанному на окислении органических веществ концентрированной серной кислотой при нагревании. Содержание общего азота в мелассе может колебаться в пределах от 0,8 до 2,2%.

Для определения азота по Кьельдалю берут от 1,5 до 2,5 г мелассы. Навеску отвешивают на аналитических весах в пробирке, которую вводят в колбу Кьельдаля, и выливают содержимое. При этом наблюдают, чтобы частицы испытуемого вещества не прилипали к горлышку колбы. Массу мелассы, взятую для анализа, определяют по разности между массой пробирки с навеской и массой пробирки после выливания мелассы. В эту же колбу с мелассой наливают 20-30 мл концентрированной химически чистой серной кислоты (относительной плотностью 1,84) и дают кислоте хорошо пропитать мелассу в течение 2-4 ч (лучше 8-10 ч), чтобы избежать пенения в процессе сжигания.

Для ускорения сжигания в колбу добавляют катализаторы. Наилучшим катализатором при сжигании органических веществ в серной кислоте является селен, которого достаточно добавить несколько крупинок. В качестве катализаторов применяют также сернокислый калий (по 1-1,5 г на каждые 10 мл серной кислоты) и сульфат меди (0,5-1 г).

Горло колбы закрывают специальной стеклянной пробкой с расширением, неплотно закрывающей колбу. Для кипячения колбу ставят в наклонное положение на сетке, чтобы ее длинное горло не нагревалось. Это горло служит воздушным холодильником; кипячение кислоты не должно быть слишком бурным, чтобы ее пары успевали сконденсироваться в горле колбы.

После того как жидкость перестанет пениться и выделение белых паров сернистого газа станет более равномерным, нагревание усиливают. Обугленные частички смывают со стенок колбы содержащейся в ней жидкостью, которая к концу реакции обесцвечивается или при сжигании с сульфатом меди приобретает голубую окраску. После полного просветления жидкости нагревание продолжают еще в течение 1-2 ч, при этом избегают бурного кипения ее и следят за тем, чтобы горло колбы не нагревалось сильно. После окончания сжигания навески в содержимом колбы определяют количество аммиака, для этого его перегоняют в колбу с титрованным раствором серной кислоты.

Перегонку производят или в специальном приборе, где можно одновременно проводить несколько определений, или в аппарате, который собирают следующим образом. Круглодонную или плоскодонную колбу вместимостью 1 л устанавливают на штатив, соединяют ее плотной резиновой пробкой с каплеуловителем, а затем с холодильником. В пробку, кроме трубки каплеуловителя, вставляют стеклянную трубку, соединенную каучуковой трубкой с небольшой воронкой, диаметром 4-5 см; на каучуковой трубке имеется винтовой зажим (рис.16).

Рис.16. Прибор для определения азота по Кьельдалю

К другому концу холодильника присоединяют стеклянную трубку с шарообразным расширением в верхней части, которую опускают почти до дна приемника. Приемником может служить обычная коническая колба вместимостью 500 мл. Все части прибора должны быть плотно пригнаны. В приемник наливают 50 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и 1-2 капли раствора метилового красного и устанавливают его так, чтобы конец трубки с шарообразным расширением был погружен в кислоту.

Содержимое колбы Кьельдаля после охлаждения разбавляют дистиллированной водой небольшими порциями и сливают через воронку в колбу для отгонки. Колбу Кьельдаля ополаскивают несколько раз водой с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости составлял около 400-500 мл. Колбу помещают на штатив и собирают аппарат, как было указано выше. Затем открывают винтовой зажим воронки и наливают 50-100 мл 33%-ного раствора гидроксида натрия. Воронку смывают небольшим количеством дистиллированной воды, завинчивают зажим и содержимое колбы взбалтывают. Наличие в колбе для отгонки избытка щелочи устанавливают при помощи кусочка лакмусовой бумажки, брошенной в колбу. Лакмусовая бумажка синеет.

Колбу для отгонки подогревают горелкой и отгоняют аммиак с водяными парами до тех пор, пока капля отгона не перестанет вызывать посинения красной лакмусовой бумажки. Для этого достаточно отогнать из колбы около половины всей жидкости.

По окончании отгонки конец трубки, опущенный в кислоту, ополаскивают водой в приемник и содержимое его титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия. Затем определяют количество миллилитров 0,1 н. раствора гидроксида натрия, израсходованное на титрование серной кислоты, не связавшейся с аммиаком, и производят расчет.

Содержание общего азота вычисляют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора серной кислоты в приемной колбе, мл; - поправочный коэффициент серной кислоты; - количество 0,1 н. раствора гидроксида натрия, пошедшее на титрование избытка раствора серной кислоты, мл; - поправочный коэффициент гидроксида натрия; 0,0014 - количество азота, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора серной кислоты; - навеска мелассы, г.

Пример. На сжигание взято 2,3716 г мелассы. В приемник налито 50 мл 0,1 н. раствора серной кислоты с поправочным коэффициентом =0,9961. На обратное титрование израсходовано 23,4 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия с поправочным коэффициентом =1,0126. Таким образом, связано аммиаком 50·0,9961-23,4·1,0126=26,2352 мл 0,1 н. раствора серной кислоты.

Содержание общего азота в мелассе составит

%.

Определение аминного азота "медным способом". Содержание азота аминокислот в мелассе колеблется от 0,1 до 0,5%. Простым и быстрым методом определения количества азота аминокислот является "медный способ". Метод основан на способности аминокислот образовывать комплексные растворимые соединения с медью, содержание которой определяют йодометрическим способом.

Сущность метода заключается в следующем. К определенному количеству испытуемого раствора, содержащего смесь аминокислот, прибавляют при слабощелочной реакции избыток суспензии фосфорнокислой меди в боратно-буферном растворе, в результате чего после взбалтывания в раствор переходят медные соли большинства аминокислот. Затем избыток фосфата меди отфильтровывают и в прозрачном растворе после добавления уксусной кислоты и йодистого калия определяют медь объемным способом по выделившемуся йоду путем титрования гипосульфитом в соответствии с реакцией

.

Каждый миллилитр 0,01 н. раствора NaSO соответствует 0,28 мг аминного азота.

Ход определения заключается в следующем. 13 г мелассы разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл. Из полученного раствора отбирают 5 мл в мерную колбочку на 25 мл, добавляют 1 н. раствора едкой щелочи до бледно-синего окрашивания (индикатор тимолфталеин) и 15 мл суспензии фосфорнокислой меди, затем доводят водой содержимое колбы до метки. После фильтрования отбирают 5 мл полученного фильтрата, добавляют 0,25 мл 80%-ной уксусной кислоты и 0,5 йодистого калия (см. приложение II).

Выделившийся йод оттитровывают из микробюретки 0,01 н. раствором гипосульфита (индикатор крахмал). Содержание азота определяют из расчета, что 1 мл 0,01 н. раствора гипосульфита соответствует 0,28 мг аминного азота.

Содержание аминного азота (в %) определяют по формуле

,

где 0,28 - количество аминного азота, эквивалентное 1 мл 0,01 н. раствора гипосульфита, мг; - объем 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедший на титрование, мл; - поправочный коэффициент гипосульфита; - навеска мелассы, взятая на анализ, г; - объем разбавленной мелассы, мл; - количество разбавленной мелассы, отобранное на осветление, мл; - объем осветленного раствора, мл; - количество фильтрата осветленной мелассы, взятое на определение, мл; 100 - пересчет в проценты; 1000 - перевод миллиграммов в граммы.

Обычно на анализ берут 13 г мелассы и проводят одно и то же разбавление ее (=100 мл), отбирают раствор на осветление (=5 мл), доводят объем осветленного раствора до 25 мл (=25 мл) и на определение берут 5 мл фильтрата.

Подставляя эти постоянные величины в уравнение и выполнив сокращения, получим

.

Пример. На титрование пошло 1,43 мл 0,01 н. раствора гипосульфита (=1,43 мл) с поправочным коэффициентом =0,9875.

Содержание аминного азота в мелассе составит

%.

     
Определение содержания золы в мелассе

В предварительно прокаленную и взвешенную платиновую или фарфоровую чашку (тигель) взвешивают на аналитических весах навеску мелассы около 3 г. Навеску обливают 1-2 мл серной кислоты относительной плотностью 1,84, размешивают платиновой проволочкой или оплавленной стеклянной палочкой, вытирают проволочку или палочку маленьким кусочком фильтровальной бумаги, который также бросают в чашку, и, держа чашку щипцами, осторожно нагревают на небольшом пламени горелки под тягой. Когда меласса перестанет пениться и выделение паров газов прекратится, ее окончательно сжигают и прокаливают до постоянной массы в муфеле при слабом калении или на горелке, при этом доводят платиновую чашку или тигель до слабо-красного каления.

Сжигание навески считается законченным, когда вся масса превратится в белый или розовый порошок, не содержащий черных частиц несгоревшего вещества. Затем чашку или тигель переносят в эксикатор, охлаждают и взвешивают.

Пример. Масса пустого прокаленного тигля 17,9632 г; масса тигля с навеской мелассы 20,9306 г; масса тигля с золой 18,2204 г; навеска мелассы 2,9674 г, масса золы 0,2572 г.

Количество углекислой золы 0,2572·0,9=0,2314 г.

Содержание золы в мелассе 0,2324·100/2,9674=7,8%.

Содержание золы в мелассе колеблется от 6 до 13%.

Определение содержания калия при сухом озолении

В фарфоровую чашку, предварительно прокаленную и доведенную до постоянной массы, берут такое количество веществ, чтобы после озоления навеска золы соответствовала примерно 0,2 г.

К навеске золы приливают в фарфоровую чашку 25-30 мл воды и нагревают на водяной бане 5 мин. Полученный раствор охлаждают, прибавляют 1-2 капли фенолфталеина (1%-ного спиртового раствора) и, приливая по каплям приблизительно полунормальную азотную кислоту, нейтрализуют раствор до обесцвечивания. Если от прибавления фенолфталеина порозовения раствора не наблюдается, то кислоту не прибавляют. Фарфоровую чашку с содержимым снова ставят на водяную баню, нагревают до появления интенсивной окраски и к нагретому раствору приливают по каплям 3-4 капли 0,05 н. раствора азотнокислого серебра для осаждения хлора.

Жидкость перемешивают, фильтруют в мерную колбу на 50 мл и несколько раз промывают малыми количествами горячей воды. К фильтрату прибавляют каплю метилового оранжевого и 0,5 н. раствора азотной кислоты до порозовения раствора (2-3 капли), после чего его охлаждают в струе холодной воды и доводят до метки.

Затем в химический стаканчик вместимостью 50-100 мл пипеткой вносят 5 мл осаждающего раствора Тананаева (реактив 1, см. приложение II). Затем в стаканчик из колбочки приливают пипеткой 25 мл анализируемого раствора. Взяв стаканчик в левую руку и слегка вращая его (для лучшего взаимодействия), правой рукой держат пипетку, из которой приливают испытуемый раствор.

Опорожнив пипетку, содержимое стаканчика перемешивают стеклянной палочкой в течение 2 мин, спустя 5 мин перемешивание ведут еще 1 мин, после чего оставляют содержимое стаканчика на 1-2 ч в покое в темном месте (лучше оставить на ночь). Состав выпавшего осадка комплексной соли калия с кобальтнитритом, содержащим серебро, следующий:     

Результаты анализа будут неточными, если в 25 мл исследуемого раствора окажется меньше 3,5 мл или больше 40 мг калия, что должно быть учтено при определении величины навески. Пока осадок отстаивается, тарируют чистый, высушенный при 110 °С стеклянный фильтрующий тигель (ТФ-4-20) и с помощью каучуковой пробки или кольца плотно вставляют его в горло колбы Бунзена, соединенной с насосом.

Одновременно готовят промывалку с дистиллированной водой, подкисленной уксусной кислотой (реактив 6). Спустя 2 ч через тигель сначала сливают жидкость над осадком, а затем переносят на фильтр и сам осадок, взбалтывая его в стаканчике при помощи промывной жидкости, наливаемой из промывалки. При этом частицы осадка, приставшие к стенкам стакана, следует снимать стеклянной палочкой с резиновым наконечником и смывать в тигель. Осадок промывают в тигле до тех пор, пока фильтрат не станет совершенно бесцветным. Достигнув этого, тигель с резиновым кольцом переносят в другую чистую колбу Бунзена и промывают 3-5 мл этилового спирта (реактив 7). Затем тигель снова переносят в чистую колбу Бунзена и промывают осадок 2-3 мл эфира (реактив 8).

Пример. Исходная навеска мелассы равна 1,0386 г. На осаждение калия отобрана половина указанной навески (1,0386 г:2=0,5193 г) мелассы. Масса осадка равна 0,0914 г. Для расчета калия, содержащегося в навеске мелассы, массу осадка умножают на коэффициент, найдя его из табл.9

Массе осадка, равной 0,0914 г, по табл.9 соответствует коэффициент, равный 0,1145. Умножая массу осадка на 0,1145, получаем массу калия в навеске, равную 0,0104 г.

Таблица 9

%.

В пересчете на KО это составит 94,2·2,0/78,2=2,4%, где 94,2 - молекулярная масса KO; 78,2 - масса двух атомов калия. Количество KО в золе будет 2,4·100/7,2=33,3%, где 7,2 - содержание золы в мелассе, %.

Ускоренный метод определения калия кобальт-нитритом натрия в азотнокислой среде (ХО ВНИИХП)

На аналитических весах в химическом стаканчике отвешивают 4-5 г мелассы, переводят ее в мерную колбочку вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки, взбалтывают и фильтруют в сухую колбочку.

В химический стаканчик отбирают пипеткой 10 мл раствора мелассы, добавляют 1,1 мл 1 н. раствора азотной кислоты и 5 мл 20%-ного свежеприготовленного раствора кобальтнитрита натрия, перемешивают палочкой и оставляют стаканчик с палочкой на 2 ч в темном месте (приготовление реактивов см. в приложении II).

Через 2 ч выпавший осадок кобальтнитрита калия фильтруют под разрежением через высушенный при 105 °С и взвешенный стеклянный фильтр ТФ-4-20, установленный в колбе Бунзена, переводя осадок на фильтр 0,01 н. раствором азотной кислоты. После этого осадок на фильтре промывают 10 раз той же кислотой по 2 мл и 5 раз по 2 мл 86-95%-ным этанолом, отсасывают почти досуха, вытирают снаружи фильтр и высушивают в течение часа при 105-110 °С. Фильтр с осадком охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах. Так как в осадке кобальтнитрита калия калий составляет 17,22%, для расчета содержания его полученную массу осадка умножают на 0,1722 и пересчитывают на 100 г мелассы по формуле

,

где - содержание калия, %; - масса фильтра ТФ-4-20 с осадком после высушивания, г; - масса фильтра ТФ-4-20 без осадка, г; - масса полученного осадка, г; - взятая навеска мелассы, г.

Для пересчета на содержание KО надо найденное количество калия умножить на коэффициент 1,2046.

Пример. Масса фильтра с осадком =11,9635 г; масса фильтра без осадка =11,8725 г; взятая навеска мелассы =5,0425 г.

%.

%.

Для подготовки стеклянных фильтров для дальнейших анализов осадок смывают и кипятят фильтры в дистиллированной воде 30 мин. Затем воду сливают и в каждый фильтр наливают крепкой серной кислоты (фильтры устанавливают в химическом стакане). Спустя 1 ч кислоту сливают, фильтры промывают, кипятят в чистой воде 30 мин и промывают до полного удаления кислоты. Чистый фильтр высушивают при 105 °С до постоянной массы.

Определение суммы солей кальция и магния

Содержание кальциевых солей в мелассе колеблется от 0,2 до 2,5% в пересчете на СаО окиси магния MgO - от 0,001 до 1,2%. Навеску мелассы в количестве 1 г или определенный объем раствора мелассы помещают в коническую колбочку вместимостью 200-250 мл, в которую добавляют определенный объем дистиллированной воды (100 мл).

Пробу хорошо размешивают вращательным движением колбочки и к полученному раствору добавляют 5 мл аммиачного буферного раствора. Затем из бюретки добавляют избыток (10-15 мл) комплексообразователя трилона Б (н/28) и добавляют 7-8 капель индикатора хромогена-черного, после чего жидкость окрашивается в зеленый цвет. Эту жидкость титруют из другой бюретки магнезиальной смесью (н/28) до появления винно-красного цвета, который образуется вследствие полного связывания ионов кальция и магния (см. приложение II).

Для определения количества солей кальция и магния в дистиллированной воде, которая была добавлена, в коническую колбочку вместимостью 200-250 мл наливают 100 мл дистиллированной воды и таким же способом определяют содержание в ней солей кальция и магния.

Количество трилона Б, пошедшее на титрование 100 мл дистиллированной воды, вычитают из общего количества трилона Б, израсходованного при определении солей кальция и магния в навеске мелассы или в растворе.

Содержание солей кальция и магния вычисляют по формуле

,*

где - общее количество трилона Б, мл; - количество трилона Б, пошедшее на титрование воды, мл; - поправочный коэффициент трилона Б; и - количество магнезиальной смеси, пошедшее на обратное титрование контроля и опыта, мл; - навеска испытуемого продукта, г; 1000 - коэффициент для пересчета миллиграммов в граммы.
________________

* Соответствует оригиналу. Примечание изготовителя базы данных.

Пример. 1 г мелассы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. К полученному раствору мелассы из бюретки добавляют 10 мл трилона Б (н/28), поправочный коэффициент равен 0,99. На обратное титрование израсходовано магнезиальной смеси 8,5 мл (поправочный коэффициент равен 1). Трилона Б на связывание ионов кальция и магния пошло

мл.

При определении содержания солей кальция и магния в 100 мл дистиллированной воды пошло 2 мл трилона Б (н/28), поправочный коэффициент равен 0,99. На обратное титрование магнезиальной смеси (н/28) пошло 1,8 мл (=1).

.

Содержание кальциевых и магниевых солей (в % к массе мелассы) определяют по формуле

%.

Для определения содержания солей кальция в мелассе применяют прямой метод определения содержания магния в мелассе и полученное его количество вычитают из суммы солей (Са+Mg), рассчитанной приведенным выше способом.

Определение содержания магния

Навеску мелассы 0,5 г переносят со 100 мл дистиллированной воды в колбочку вместимостью 250 мл, хорошо размешивают до полного растворения мелассы, нейтрализуют несколькими каплями соляной кислоты (1:1) до перехода бумажки конго к сине-фиолетовому цвету.

Для осаждения ионов кальция добавляют 5-10 мл насыщенного раствора щавелевокислого аммония, энергично взбалтывают 2-3 мин и оставляют на холоде в течение 15-20 мин. Затем добавляют 10 мл аммиачного буферного раствора, 10-15 мл комплексообразователя трилона Б (0,05 н.), сухого индикатора хромогена-черного (на кончике стеклянной палочки) и титруют 0,05 н. раствором сернокислого магния до перехода окраски индикатора от зеленого в оранжево-красный.

Содержание магния (в %) рассчитывают по формуле

,

где - количество MgO, %; - количество трилона Б, взятое на определение, мл; - поправочный коэффициент трилона Б; - количество 0,05 н. раствора сернокислого магния, пошедшее на титрование, мл; - навеска мелассы, г; 1000 - перевод миллиграммов в граммы; 1,008 - коэффициент перевода миллилитров трилона Б в MgO (1 мл 0,05 н. раствора трилона Б соответствует 1,008 мг MgO).

Определение буферности мелассы

Буферность - это свойство мелассы противостоять изменению реакции (рН) под влиянием кислоты или щелочи. Буферность зависит от состава несахаров и их количества в мелассе, главным образом от соотношения солей калия, натрия, кальция и магния, а также от количества аминного азота.

Ход определения заключается в следующем. На технических весах в стаканчике вместимостью 100 мл отвешивают 25 г мелассы, добавляют 25 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают до полного растворения ее. В растворе определяют рН. Затем из бюретки постепенно приливают 1 н. раствор серной кислоты и определяют количество его, необходимое для изменения рН мелассного раствора до 4,5 или 5. Израсходованное количество миллилитров 1 н. раствора серной кислоты умножают на 4, получают расход ее на 100 г мелассы.

Мелассы с нормальной буферностью характеризуются постепенным снижением рН мелассного раствора в пределах 7-5 при затрате на титрование по 0,8-0,6 мл 1 н. раствора серной кислоты, а до рН 4 - при дополнительном расходе 0,6-0,5 мл 1 н. раствора серной кислоты.

При повышенной буферности мелассы для снижения рН в пределах 7-5 требуется 1,2-2,3 мл 1 н. раствора серной кислоты, а для снижения рН до 4 расходуется 2-4 мл 1 н. раствора серной кислоты.

Буферность мелассы имеет значение при осветлении ее по холодно-кислотному способу и подкислении до рН 4,5-5. Для мелассы нормальной буферности расход серной кислоты меньше.

Определение расхода серной кислоты для осветления мелассы

На технических весах в стаканчике вместимостью 100 мл отвешивают 25 г мелассы, добавляют 25 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения мелассы и определяют рН раствора. Затем из бюретки приливают постепенно 1 н. раствор серной кислоты и определяют количество ее, необходимое для сдвига рН мелассного раствора до значения рН 4,5-5.

Расход серной кислоты на 1 т мелассы вычисляют исходя из найденного количества 1 н. раствора серной кислоты, пошедшего на титрование 25 г мелассы.

Пример. На титрование 25 г мелассы израсходовано 6,9 мл 1 н. раствора серной кислоты, что соответствует 6,9·0,049=0,338 г 100%-ной концентрированной серной кислоты, а на 1 кг мелассы расход серной кислоты составит 0,338·1000/25=13,5 г; на 1 т мелассы потребуется 13,5 кг 100%-ной серной кислоты или 14,4 кг (относительной плотностью 1,83).

Определение цветности мелассы

Цветность определяют путем сравнения окраски 2%-ного раствора мелассы с окраской раствора йода и выражают ее в миллилитрах 0,1 н. раствора йода. Обычно цветность нормальной мелассы соответствует 2 мл 0,1 н. раствора йода.

Отвешивают в химическом стакане 20 г мелассы и при помощи горячей дистиллированной воды смывают ее в мерную колбу вместимостью 100 мл. Раствор после охлаждения доводят до метки, 10 мл этого раствора разводят в мерной колбе вместимостью 100 мл в 10 раз, доливая содержимое колбы до метки водой, взбалтывают и фильтруют. 50 мл фильтрата помещают в стаканчик, в другой стаканчик такого же объема наливают 47 мл дистиллированной воды, стаканчик ставят против света, в стаканчик с водой наливают из бюретки 0,1 н. раствора йода до выравнивания окраски жидкости в обоих стаканчиках.

Количество миллилитров 0,1 н. раствора йода умножают на 2, чтобы выразить цветность мелассы по отношению к 100 мл 2%-ного раствора ее.

Определение содержания летучих кислот методом отгонки с водяным паром

К летучим кислотам мелассы относятся масляная, муравьиная, уксусная, валериановая, пропионовая. Эти кислоты в свободном состоянии даже в небольших количествах (0,006-0,008%) угнетают рост дрожжей. Большинство летучих кислот в мелассе находится в форме солей, которые менее вредны, чем свободные кислоты.

Содержание летучих кислот в свекловичной мелассе за последние пять лет колеблется в пределах от 0,33 до 1,15%. Оно не должно превышать 1,2%.

Количественное определение летучих кислот в мелассе основано на разложении солей этих кислот серной или фосфорной кислотой с последующей отгонкой их с водяным паром и определением их в дистилляте титрованием щелочи.

Для определения отвешивают 20 г мелассы и растворяют в 200 мл дистиллированной воды в колбе вместимостью 500 мл (рис.17), в которую прибавляют по каплям (до посинения бумажки конгорот) 0,5-1,0 мл серной кислоты (относительной плотностью 1,84) или 1,0 мл фосфорной кислоты (относительной плотностью 1,66) и закрывают ее резиновой пробкой. В пробке имеется два отверстия, через которые проходят стеклянные трубки: одна соединяется с парообразователем 1 и доходит почти до дна колбы 2 , а другая кончается у нижнего края пробки и соединяется с холодильником. Эта трубка служит для отвода дистиллята из колбы 2 в приемную колбу 3 вместимостью 250 мл. В качестве парообразователя применяют или специальный медный (или жестяной) сосуд, или стеклянную колбу вместимостью 2-3 л.

Парообразователь закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой, доходящей до дна сосуда; эта трубка служит предохранителем для предотвращения случайного повышения давления в процессе работы. Сначала воду в парообразователе 1 нагревают до кипения, затем его соединяют с перегонной колбой, содержимое которой предварительно подогревают. Летучие кислоты отгоняют при одновременном подогревании колбы и парообразователя. Нагревание парообразователя регулируют так, чтобы объем жидкости в отгонной колбе не увеличивался от конденсации поступающего пара и оставался постоянным. Отгоняют 5-6 порций дистиллята по 200 мл и титруют каждую партию 0,1 н. раствором гидроксида натрия в присутствии фенолфталеина.

Рис.17. Прибор для определения летучих кислот

Отгонку летучих кислот заканчивают при получении двух следующих одна за другой порций дистиллята, имеющих одинаковую кислотность. Из количества миллилитров щелочи, пошедшего на титрование каждой порции отгона, вычитают количество миллилитров щелочи, израсходованное на титрование последней порции. Полученное таким образом количество миллилитров щелочи, затраченное на титрование каждой порции, кроме последней, складывают, умножают на 5 и на 0,006 и получают количество летучих кислот в 100 г мелассы в пересчете на уксусную кислоту.

Содержание летучих кислот в мелассе (в %) определяют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора гидроксида натрия, затраченное на титрование каждой порции, кроме последней, мл; - поправочный коэффициент к 0,1 н. раствору гидроксида натрия; 0,006 - содержание уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия, г; 100 - пересчет на проценты; - навеска мелассы, г.

Пример. Количество 0,1 н. раствора гидроксида натрия, затраченное на титрование каждой порции, кроме последней, равно 31,1 мл, поправочный коэффициент к щелочи =1,0052, навеска мелассы 20 г.

Подставляя значения в формулу, определяют содержание летучих кислот в мелассе

%.

     
Ускоренный метод определения содержания летучих кислот (ХО ВНИИХП)

Прибор для отгонки летучих кислот (рис.18) состоит из широкогорлой конической колбы для отгонки 1 вместимостью 1,5-2 л, служащей парообразователем, холодильника 2 , приемной колбы 3 , перегонного аппарата типа эбулиостата, представляющего собой пробирку 4 . Общая длина пробирки 28 см, длина суженой части 6,5 см. В верхней части пробирки впаяна доходящая почти до дна тонкая изогнутая трубка 5 .

Рис.18. Прибор для определения летучих кислот ускоренным методом

Пробирка 4 соединена с парообразователем 1 с помощью резиновой пробки с двумя отверстиями. В одно отверстие вставляют предохранительную стеклянную трубку, на которую надета каучуковая трубка 6 с винтовым зажимом, а на второе - суженую часть пробирки, соединяющуюся с каплеуловителем 7 . Последний соединен с холодильником, он устраняет опасность попадания в холодильник отдельных капелек кислого раствора мелассы, уносимых при барботировании с паром. Парообразователь примерно на 2/3 наполняют дистиллированной водой, чтобы во время кипения вода не заливала отверстия трубки 5 , устанавливают на электроплитку или другой нагревательный прибор, кипятят воду в течение 10-15 мин, после чего в кипящую воду помещают аппарат с раствором мелассы.

Отвешивают 50 г мелассы и количественно переводят с теплой дистиллированной водой в мерную колбу на 100 мл. Раствор охлаждают до 20 °С, доводят до метки, тщательно перемешивают и подкисляют 10%-ным раствором серной кислоты до рН 3-3,2. При этом определяют количество серной кислоты, пошедшее на подкисление.

В химический стаканчик вносят пипеткой 10 мл приготовленного раствора мелассы, что соответствует 5 г мелассы, и добавляют по 0,5 мл 10%-ный раствор серной кислоты, каждый раз замеряя активную кислотность (рН).

Затем приступают к отгонке летучих кислот. В чистый аппарат для отгонки осторожно по стенке вносят пипеткой установленное количество 10%-ной серной кислоты, затем туда же добавляют каплю олеиновой кислоты и вводят пипеткой 10 мл раствора мелассы. Двумя-тремя миллилитрами дистиллированной воды смывают верхнюю часть трубки аппарата, по которой вносили растворы.

Подготовленный таким образом отгонный аппарат помещают в колбу-парообразователь с кипящей водой, быстро соединяют с каплеуловителем и холодильником и только после этого закрывают зажим на предохранительной трубке 6 . Образующийся при кипении воды пар из колбы 1 через трубку 5 попадает в пробирку 4 и, барботируя раствор мелассы, уносит с собой летучие кислоты в холодильник.

Отгонка летучих кислот ведется в мерную колбочку на 50 мл. Длительность отгонки 50 мл составляет 10-15 мин.

По окончании отгонки отставляют приемную колбочку и открывают зажим на предохранительной трубке 6 . Содержимое мерной колбочки переводят в коническую колбочку, мерную колбочку дважды ополаскивают 5 мл свежекипяченой дистиллированной водой, сливают в коническую колбочку с отгоном и титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия в присутствии индикатора фенолфталеина до слабо-розового окрашивания.

При отсутствии мерных колбочек отгон можно собирать в обыкновенные конические колбочки на 100-150 мл, на которые предварительно наносят метку, соответствующую 50 мл. Титрование щелочью ведут в этих же колбочках.

Содержание летучих кислот рассчитывают на 100 г мелассы (сухое вещество) с условным пересчетом на уксусную кислоту.

Содержание летучих кислот (в %) определяют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора гидроксида натрия, пошедшее на титрование 50 мл отгона, мл; 0,006 - количество уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия; 5 - навеска мелассы, г.

Пример. На титрование 50 мл отгона пошло 6,8 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Следовательно, в 100 г мелассы содержится летучих кислот 6,3·0,12=0,816%.

Для пересчета на сухое вещество мелассы нужно найденное количество летучих кислот разделить на содержание сухих веществ и умножить на 100.

В мелассе содержится 74,5% СВ. Тогда количество летучих кислот, считая на сухое вещество, составит 0,816·100/74,5=1,1%.

Определение содержания сернистого ангидрида

Содержание сернистого ангидрида в мелассе не должно превышать 0,05%. Наличие сернистого ангидрида в мелассе тормозит рост дрожжей, а прессованные дрожжи, выращенные на такой мелассе, имеют свойство быстро изменять свое качество и темнеть при хранении.

Сущность метода определения состоит в окислении йодом сернистой кислоты в серную.

Колбу (рис.19) 1 для отгона вместимостью 500 мл закрывают каучуковой пробкой с двумя отверстиями. В одно отверстие вставляют воронку 4 для ввода исследуемой жидкости, другое отверстие сообщается посредством каплеуловителя с одним концом холодильника 3 , другой конец которого должен быть опущен в приемную колбу 2 .

Рис.19. Прибор для определения сернистого ангидрида

В колбу для отгона наливают 20 г мелассы, разбавляют 250-300 мл воды и добавляют 15 мл 25%-ного раствора ортофосфорной кислоты. В приемную колбу отмеривают точно 25 мл 0,1 н. раствора йода и помещают в баню со льдом.

Конец холодильника погружают в йодный раствор, дистилляцию ведут на медленном огне. Отгонку продолжают до тех пор, пока половина жидкости будет отогнана до прекращения выделения пузырьков газа. Общая длительность отгонки должна быть не менее 2,5 ч. Затем холодильник смывают дистиллированной водой в приемную колбу и количество йодного раствора, не вошедшее в реакцию, титруют 0,1 н. раствором гипосульфита в присутствии нескольких капель 1%-ного раствора крахмала.

Одновременно для установления поправки на окисляемость йодом находящихся в растворах веществ проводят глухой опыт с таким же количеством реактивов, но без навески мелассы. Продолжительность глухого опыта должна соответствовать продолжительности отгонки.

Содержание сернистого ангидрида (в %) в мелассе определяют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора йода, мл; - поправочный коэффициент к 0,1 н. раствору йода; - количество 0,1 н. раствора гипосульфита, израсходованное на титрование, мл; - количество 0,1 н. раствора гипосульфита, израсходованное в глухом опыте, мл; - поправочный коэффициент к 0,1 н. раствору гипосульфита; 0,0032 - содержание SO, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора йода, г; 100 - пересчет в проценты; - навеска мелассы, г.

На анализ всегда берут 20 г мелассы и 25 мл 0,1 н.раствора йода. Подставляя эту величину в уравнение, получим его в упрощенном виде

.

Пример. Для определения SO взято 20 г мелассы, в приемную колбу добавлено 25 мл 0,1 н. раствора йода. При титровании израсходовано 22,4 мл 0,1 н. раствора гипосульфита с поправочным коэффициентом =1,0197. Поправочный коэффициент 0,1 н. раствора йода =1. На глухой опыт израсходовано 24,1 мл гипосульфита.

Подставляя значения в формулу, определяют содержание сернистого ангидрида в мелассе

.

     
Определение содержания коллоидов

Повышенное содержание коллоидов в мелассе вызывает сильное вспенивание в процессе переработки. Допустимым является содержание коллоидов, равное 4-7% к мелассе.

Содержание коллоидов в мелассе определяют по методу А.В.Думанского и С.Е.Харина. 15 г мелассы разбавляют дистиллированной водой до содержания сухих веществ, равного 10%. В случае щелочной реакции раствор нейтрализуют соляной кислотой по фенолфталеину. На 100 мл раствора мелассы добавляют 5 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты, при этом колебание рН полученного раствора допускается в пределах 4-6.

Подкисленный раствор мелассы разбавляют дистиллированной водой до содержания сухих веществ, равного 5%, и из вновь разбавленного раствора отбирают на определение коллоидов 5 мл в колбочку вместимостью 100 мл, куда заранее наливают смесь, состоящую из 50 мл этилового спирта и 2,5 мл серного эфира.

Колбочку закрывают корковой пробкой, через которую проходит обратный холодильник, погружают в водяную баню, нагретую до кипения. Кипение содержимого колбы поддерживают в течение 3-4 мин. После охлаждения содержимое колбы фильтруют через заранее высушенный до постоянной массы плотный беззольный или фильтрующий тигель ТФ-4-20.

Осадок на фильтре промывают 80-100 мл смеси, состоящей из 100 мл спирта, 5 мл эфира и 10 мл дистиллированной воды. Промытый осадок вместе с фильтром переносят в бюкс и высушивают до постоянной массы при температуре 100-101 °С. Количество коллоидов выражают в процентах к массе.

Пример. 15 г мелассы, взятые для определения коллоидов, разбавлены дистиллированной водой до содержания сухих веществ, равного 10%. Получено 110 мл раствора, к которому добавлено 5,5 мл 0,1 н. раствора НСl. Общий объем равен 115,5 мл, 50 мл полученного раствора разбавлено водой вдвое (до 100 мл), на определение взято 5 мл этого раствора.

Таким образом, в реакции осаждения коллоидов участвовало мелассы

г.

Количество высушенного осадка коллоидов равно 0,0205 г. В 0,325 г мелассы содержится 0,0215 г коллоидов; в 100 г равно 6,3 г (0,0205·100/0,325) или в исследуемой мелассе содержится 6,3% коллоидов.

Определение пенистости мелассы

20 мл раствора мелассы, содержащего 1,5% СВ, подкисляют до рН 4,7-5, помещают в мерный цилиндр с притертой пробкой вместимостью 50 мл и энергично встряхивают в течение 1 мин. Через 30 с после окончания встряхивания определяют высоту столба пены. Пенообразовательная способность мелассы характеризуется высотой столба пены, которая у нормальной мелассы должна быть не более 40 мм. Образовавшаяся пена постепенно исчезает. Время, в течение которого пена оседает на 10 мм, определяет стабильность ее. Продолжительность оседания пены должна быть не более 10 мин.

Определение содержания нефтяных продуктов

Метод основан на экстрагировании нефтяных продуктов, содержащихся в мелассе, петролейным эфиром с последующим отделением эфира и высушиванием полученного остатка до постоянной массы. Если в мелассе содержатся одновременно жиры, то их необходимо предварительно удалить омылением 0,1 н. раствором гидроксида натрия.

В коническую колбу вместимостью 150-200 мл отвешивают 50 г неразбавленной мелассы, добавляют 15-20 мл 0,1 н. KОН до ясной щелочной реакции и производят омыление, нагревая колбу в течение 30 мин на кипящей водяной бане. Полученный раствор переносят в делительную воронку вместимостью 300 мл, приливают 100 мл петролейного эфира (фракция петролейного эфира, перегоняемая при температуре до 60 °С) и взбалтывают в течение 30-40 мин до образования однородной смеси.

Смесь для расслаивания оставляют на несколько часов. При задержке расслаивания рекомендуется добавить 1-2 мл этилового спирта. Нижний слой, который представляет собой разбавленную мелассу, удаляют. Эфирный слой сливают в предварительно взвешенную колбу или бюкс. Удалив эфир на водяной бане, остаток высушивают при 60 °С до постоянной массы и взвешивают. Путем умножения массы на 2 получают количество нефтяных продуктов в мелассе в процентах.

Ускоренный метод оценки степени пригодности мелассы для дрожжевого производства по скорости роста дрожжей (технологическая микропроба)

При выращивании дрожжей очень важно, чтобы скорость накопления биомассы была устойчивой и стабильной при переработке мелассы разного состава. Поэтому при оценке степени пригодности мелассы для дрожжевого производства необходимо выявлять показатель скорости роста дрожжей на исследуемой мелассе. Однако в условиях заводских лабораторий химическими анализами невозможно быстро установить содержание в мелассе всех компонентов, стимулирующих или подавляющих рост дрожжей. Поэтому во ВНИИХПе разработан ускоренный метод определения степени пригодности мелассы для дрожжевого производства по скорости роста дрожжей (технологическая микропроба).

Наиболее точные результаты по определению скорости роста дрожжей в зависимости от состава мелассы получаются при выращивании дрожжей в течение первых 6 ч. В этот период нет недостатка в питательных веществах и кислороде для нормального размножения дрожжей.

Сущность метода заключается в культивировании 30 г дрожжей в течение 6 ч в лабораторном дрожжерастильном аппарате с расходом 90 г мелассы, содержащей 46% сахара и добавлением азот- и фосфорсодержащих солей (6,65 г сернокислого аммония и 2,64 г диаммонийфосфата).

После шестичасового выращивания определяют количество полученных дрожжей на исследуемой мелассе и скорость роста дрожжей - натуральный логарифм отношения полученных дрожжей к засевным в единицу времени, который вычисляют по формуле

,

где - скорость роста дрожжей; - биомасса, накопленная за определенный промежуток времени, г; - биомасса, взятая для засева, г; - продолжительность выращивания дрожжей.

Для выращивания дрожжей используется дрожжерастильный аппарат 1 (рис.20) из нержавеющей стали полезной вместимостью 3 л с воздухораспределительной системой 2 . Для поддержания необходимой температуры во время размножения дрожжей аппарат помещают в водяную баню 3 с контактным термометром 4 , установленную на электроподогрев 5 . Питательные вещества (меласса, растворы сернокислого аммония, диаммоний фосфата и аммиачная вода) поступают из сосудов 6 , 7 , 8 , 9 , установленных над аппаратом. Приток питательной среды регулируют при помощи программного регулирующего устройства или кранов по указателю уровня в соответствии с графиком расхода мелассы и питательных солей. Для аэрации среды в дрожжерастильный аппарат по воздуховоду 10 подают воздух, расход которого учитывают по счетчику 11 .

Показатели	Норма
Внешний вид	Белые или слабо-желтые кристаллы
Массовая доля основного вещества в сухом продукте, %, не менее
в пересчете на сульфат аммония	99
в пересчете на азот	21
Массовая доля влаги, %, не более	0,6
Массовая доля мышьяка, %, не более	0,0005
Сульфиды и сульфиты, мл, не более	0,5 (по высоте черного кольца)

Рис.21. Прибор для определения сульфидов и сульфитов

Насадку прибора заряжают следующим образом. В нижний конец трубочки насадки помещают кусочек чистой ваты, на которую накладывают вату, смоченную уксуснокислым свинцом. Все плотно утрамбовывают стеклянной палочкой. В верхний конец трубочки помещают чистый кусочек ваты. После зарядки трубочки в сосуд помещают 4 г металлического цинка. Сосуд немедленно закрывают заряженной насадкой и прибор ставят в темное место. За реакцией ведут наблюдение в течение 4 ч, после чего измеряют величину темного кольца на ватке, смоченной уксуснокислым свинцом, возникающего при наличии вредных примесей в сульфате аммония.

Если величина темного кольца на ватке, смоченной уксуснокислым свинцом, превышает 0,5 мм, т.е. сульфат аммония содержит вредные примеси, перед его использованием производят выдерживание на воздухе.

В процессе приготовления раствора из такого сульфата аммония проводят его выстаивание в течение 4 ч или продувание воздухом в течение 2 ч.

Определение массовой доли влаги. Около 5 г сульфата аммония взвешивают с точностью до 0,0002 г и сушат в сушильном шкафу при 100-110 °С до постоянной массы. Массовую долю влаги выражают в процентах.

Определение массовой доли сульфата аммония. 20 г сульфата аммония растворяют в воде (дистиллированной), переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят водой до метки. Из полученного раствора отбирают пипеткой 25 мл и нейтрализуют 0,1 н. раствором гидроксида натрия с индикатором метиловым красным. Затем прибавляют 25 мл формалина, предварительно нейтрализованного 33%-ным раствором гидроксида натрия в присутствии фенолфталеина. Свободную серную кислоту, выделившуюся при этом, титруют 0,5 н. раствором гидроксида натрия в присутствии фенолфталеина.

Массовую долю сульфата аммония (в %) в пересчете на сухое вещество определяют по формуле

,

где - объем точно 0,5 н. раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование сульфата аммония, мл; - навеска сернокислого аммония, г; - массовая доля влаги в пробе, %; 0,03303 - количество сульфата аммония, соответствующее точно 1 мл 0,5 н. раствора гидроксида натрия, г.

Для пересчета на азот процентное содержание сульфата аммония умножают на 0,212.

Определение массовой доли мышьяка. 5 г сульфата аммония взвешивают с точностью до 0,001 г и ведут определение по методике, описанной на с.96.

Аммиак водный

Аммиак применяют одновременно как источник азота и для регулирования рН среды при выращивании дрожжей. В дрожжевом производстве используют аммиак водный технический (ГОСТ 9-77*) - раствор синтетического аммиака в воде. Водный аммиак выпускают марок А и Б. Для дрожжевого производства используют аммиак марки А. Определяется содержание аммиака.

______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 9-92. - Примечание изготовителя базы данных.

Процентное содержание аммиака в водном растворе определяют по относительной плотности и титрованием. Относительную плотность аммиачного раствора определяют пикнометром или ареометром, затем устанавливают процентное содержание аммиака.

При определении содержания аммиака титрованием отбирают при помощи бюретки в мерную колбу вместимостью 200 мл 10 мл испытуемого раствора, доливают до метки дистиллированной водой и раствор тщательно перемешивают. 5 мл полученного раствора отбирают пипеткой и переносят в колбу для титрования, доводят дистиллированной водой до 50 мл и титруют 0,1 н. раствором серной кислоты с индикатором метиловым красным до розового оттенка. Количество миллилитров кислоты, затраченное на титрование и умноженное на 0,0017 (количество граммов аммиака, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора серной кислоты), дает содержание аммиака в 5 мл раствора. Содержание аммиака в испытуемом растворе определяют по формуле

,

где - количество аммиака в 5 мл раствора, взятое для титрования, г.

Диаммонийфосфат

Диаммонийфосфат (NH)НРО используют как источник фосфора и азота. Диаммонийфосфат технический изготовляют двух марок (А и Б) со следующими показателями.

Определяется содержание фосфорного ангидрида, аммиака, мышьяка, влаги, фтора.

Определение содержания массовой доли фосфорного ангидрида. Отвешивают в стаканчик 1,0-1,2 г диаммонийфосфата с погрешностью не более 0,001 г и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл. При 20 °С доводят водой до метки, смесь перемешивают и 10 мл отбирают в мерную колбочку на 100 мл. Доводят водой до метки, перемешивают, на определение фосфата отбирают в пробирку 1 мл и ведут определение калориметрическим методом Бригса.

Определение массовой доли аммиака. Навеску около 2,5 г продукта взвешивают с точностью до 0,001 г, переводят в мерную колбу вместимостью 250 мл, растворяют дистиллированной водой и объем доводят до метки. Из раствора отбирают пипеткой 25 мл и переносят в коническую колбу вместимостью 150 мл, сюда же прибавляют 2-3 капли фенолфталеина и нейтрализуют 0,1 н. раствором гидроксида калия до слабо-розового окрашивания. После этого добавляют 10-15 мл нейтрализованного раствора формалина (40%-ного) и вторично титруют 0,1 н. раствором гидроксида калия до появления слабо-розового окрашивания.

Количество аммиака (в %) определяют по формуле

,

где - объем 0,1 н. раствора гидроксида калия, пошедший на титрование, мл; 0,0017 - количество NH, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидроксида калия, г; - навеска испытуемого продукта - диаммонийфосфата, г.

Определение массовой доли влаги. 5 г диаммонийфосфата отвешивают на аналитических весах и сушат в термостате при температуре 60 °С до постоянной массы. Содержание массовой доли (в %) определяют по формуле

,

где - содержание массовой доли влаги в навеске после высушивания, г; - масса навески до высушивания, г.

Определение массовой доли мышьяка. 5 г продукта отвешивают с точностью до 0,001 г и ведут определение по методике (см. с.96).

Определение массовой доли фтора. Содержание водорастворимого фтора в диаммонийфосфате допускается в количестве не выше 0,01%.

Наличие водорастворимого фтора угнетающе действует на процесс размножения дрожжей, поэтому контроль за соблюдением указанных норм имеет большое значение. Количество фтора в среде дрожжерастильного аппарата не должно превышать 0,001%.

Метод определения фтора основан на приводимых ниже реакциях, происходящих при смешивании исследуемого вещества с кварцевым песком, с разбавленной серной кислотой и при нагревании.

;

;

.

При избыточном количестве SiO кремнефтористоводородная кислота подвергается дистилляции, количественно переходя в приемник; чистая HSiF улетучивается при 40 °С без остатка, причем отношение SiF:HF меняется в зависимости от концентрации HSiF. Обычно остаток обогащается HF, но при наличии SiO превращается в новое количество HSiF и т.д. Дистиллят смешивают с KCl, причем выделяется KSiF, который может быть отфильтрован; осадок растворяют горячей водой и раствор титруют щелочью.

;

.

Для определения берут навеску около 1,5 г исследуемого материала и 2 г прокаленного морского песка; все это помещают в круглодонную колбу 1 для отгонки (рис.22), соединенную при помощи трубки 2 с шариковым холодильником, конец которого опущен в коническую приемную колбу 3 вместимостью 100-150 мл. На дно приемной колбочки помещают 3-4 г химически чистого хлористого калия, предварительно измельченного (растертого) в ступке. В круглодонную колбу наливают 30 мл серной кислоты, разбавленной водой 1:3, и колбу подогревают. Приемную колбу, в которую поступает отгон, время от времени встряхивают.

Рис.22. Прибор для определения фтора

Отгонку ведут до тех пор, пока в круглодонной колбе не останется 5-10 мл жидкости и не появятся белые пары SO, а отгона наберется 20-25 мл. По окончании отгонки трубки и холодильник смывают 20-30 мл 96%-ного этилового спирта (в зависимости от количества отгона) до образования 50%-ного раствора спирта.

Приемную колбу закрывают пробкой и оставляют на 2-4 ч. Затем жидкость с осадком фильтруют через бумажный фильтр. Осадок промывают на фильтре 3-4 раза 20%-ным раствором хлористого калия, а затем 50%-ным раствором спирта до нейтральной реакции по метиловому оранжевому (в фильтрате).

После промывания фильтр вместе с осадком опускают в чистую сухую коническую колбочку вместимостью 100-160 мл и растворяют горячей дистиллированной водой (без СО). Раствор осторожно доводят до кипения и тотчас же титруют 0,1 н. раствором гидроксида калия. В конце титрования кипячение повторяют, а раствор вновь титруют до розового окрашивания его с индикатором фенолфталеином.

Количество кремнефтористоводородной кислоты (в %) определяют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора щелочи, мл; - навеска вещества, г; 0,0144 - количество кремнефтористоводородной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора щелочи (14,4/4 г выражает эквивалент 0,1 н. раствора кремнефтористоводородной кислоты, следовательно, 1 мл данного раствора соответствует 14,4/4·1000=0,0144/4 г кремнефтористоводородной кислоты).

Количество кремнефтористоводородной кислоты (в %) пересчитывают на количество содержащегося в ней фтора по формуле

,

где - количество кремнефтористоводородной кислоты, %; - количество фтора, %; 114 - молекулярная масса ; 144 - молекулярная масса кремнефтористоводородной кислоты НSiF.

Кукурузный экстракт

Кукурузный экстракт используют в дрожжевом производстве как источник активаторов роста, в основном биотина. Кукурузный экстракт получают путем уваривания под вакуумом экстрактных замочных вод, являющихся побочным продуктом (отходом) кукурузнокрахмального производства.

Состав кукурузного экстракта характеризуется следующими показателями. По внешнему виду - густая непрозрачная жидкость с хлопьевидной взвесью, способной расслаиваться, или почти однородная паста. Цвет кукурузного экстракта от желтого до темно-коричневого, запах, характерный для кукурузы, содержание сухих веществ не менее 48%, кислотность (в % молочной кислоты) не менее 17,0%, свободного сернистого газа не более 0,35%, содержание золы не более 21,0% (в пересчете на СВ). В кукурузном экстракте определяются содержание сухих веществ и кислотность.

Арбитражный метод определения сухих веществ. Для определения сухих веществ данным методом бюксу с бумажными роликами высушивают до постоянной массы. Для изготовления бумажных роликов разрезают лист фильтровальной бумаги на полоски шириной 10 мм и длиной 500 мм и скатывают в нетугие ролики.

В бюксу кладут 3-4 ролика и высушивают до постоянной массы при температуре 105 °С. Сначала его помещают в сушильный шкаф на 3 ч, охлаждают в эксикаторе, взвешивают, а затем сушат по 30 мин до тех пор, пока разница между двумя последующими взвешиваниями не будет превышать 0,001 г.

Высушенные ролики опрокидыванием помещают в крышку бюксы. В бюксу без крышки берут навеску экстракта 1-1,5 г с погрешностью не более 0,0002 г. К навеске приливают примерно двойное количество дистиллированной воды, подогретой до 30-40 °С, и содержимое бюксы, помешивая круговым движением для равномерного растворения продукта. Затем в бюксе помещают ролики, в которые раствор должен полностью впитаться.

Бюксу с открытой крышкой ставят в сушильный шкаф и сушат в течение 4 ч при температуре 60 °С. После этого температуру в шкафу увеличивают до 105 °С и экстракт выдерживают при этой температуре сначала 6-8 ч, охлаждают в эксикаторе 30 мин, взвешивают, а затем сушат по 30 мин до тех пор, пока разница между двумя последующими взвешиваниями не будет превышать 0,001 г.

Содержание сухих веществ кукурузного экстракта (в %) рассчитывают по формуле

,

где - масса бюксы с роликами, г; - масса кукурузного экстракта до высушивания, г; - масса бюксы с экстрактом и роликами после высушивания, г.

Определение кислотности. Взвешивают 2 г экстракта с точностью 0,001 г, переносят количественно в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводят нейтральной (предварительно оттитрованной перед определением кислотности до такой же окраски, как указано ниже) дистиллированной водой до метки при температуре 20 °С и хорошо перемешивают. 50 мл полученного раствора титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания в присутствии фенолфталеина до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин.

Кислотность экстракта выражают в процентах молочной кислоты в пересчете на СВ экстракта и вычисляют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора гидроксида натрия, пошедшее на титрование, мл; - содержание сухих веществ в сгущенном кукурузном экстракте, %; 0,009 - количество молочной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия, г; 0,5 - масса кукурузного сгущенного экстракта в объеме раствора, взятом на титрование, г.

Определение содержания азотистых веществ методом Кьельдаля. Навеску экстракта в количестве 0,8-1,2 г в колбе Кьельдаля заливают 20-30 мл серной кислоты (относительной плотностью 1,84) и ведут определение, как указано выше.

В качестве индикатора применяют смесь метиленового голубого (0,412 г) и метилового красного (0,624 г) в 500 мл 96%-ного этилового спирта.

Параллельно ставят контрольный опыт (без навески экстракта) и количество миллилитров 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование контроля, вычитают из показателя, полученного при основном определении. Содержание азотистых веществ выражают в процентах в пересчете на сухое вещество экстракта и вычисляют, исходя из того, что 1 мл 0,1 н. HSO связывает 0,0014 г азота, по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора серной кислоты, взятое в приемник, мл; - количество 0,1 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование избытка серной кислоты, мл; - навеска экстракта, г; - содержание сухих веществ в экстракте, %.

Определение содержания сернистого газа. Сущность метода заключается в окислении свободного сернистого газа раствором йода. 50 мл раствора, приготовленного для определения кислотности (соответствует 0,5 г экстракта), помещают в колбу Эрленмейера, прибавляют 3-5 капель раствора 1%-ного крахмала и титруют 0,02 н. раствором йода в йодистом калии до появления синего окрашивания. Затем добавляют 2-3 капли разбавленной соляной кислоты (1:5), 7-10 капель 1%ного раствора крахмала и снова титруют до появления синего окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Содержание свободного сернистого ангидрида (в %) в пересчете на сухое вещество рассчитывают по формуле

,

где - количество 0,02 н. раствора йода, пошедшее на титрование, мл; - содержание сухих веществ в экстракте, %; 0,0064 - количество SO, соответствующее 1 мл 0,02 н. раствора йода, г; 0,5 - масса экстракта в 50 мл раствора, г.

Определение содержания общей золы. Сущность метода заключается в определении остатка несгоревшего экстракта при сжигании в муфельной печи при температуре 600-700 °С.

В предварительно прокаленном и взвешенном тигле взвешивают на аналитических весах 4-3 г экстракта, смачивают его поверхность 2-3 каплями чистого растительного масла (подсолнечного по ГОСТ 1129-73 или кукурузного по ГОСТ 8808-73), осторожно упаривают и сжигают на слабом огне. Затем тигель помещают для предварительного прокаливания в раскаленный муфель при температуре 400-500 °С, после чего поднимают температуру в муфеле до 600-700 °С. Тигель с золой прокаливают до постоянной массы. Содержание золы (в %) в пересчете на сухое вещество экстракта определяют по формуле

,

где - масса тигля, г; - масса тигля с экстрактом, г; - масса тигля с золой, г; - содержание сухих веществ в экстракте, %.

Определение содержания биотина. В кукурузном экстракте количество биотина определяют по той же методике, что и в мелассе (см. с.47). Разница заключается в том, что навеска экстракта значительно меньше (для определения биотина берут от 0,01 до 0,03 г экстракта).

В кукурузном экстракте содержится биотина от 0,5 до 2 мкг в 1 г. В экстракте хорошего качества содержится от 1,6 до 2 мкг биотина в 1 г вещества.

Оценка кукурузного экстракта как источника стимуляторов роста дрожжей по технологической пробе. Метод основан на определении способности исследуемого образца увеличивать выход дрожжей. Хороший экстракт позволяет повысить выход дрожжей на 20-25% по сравнению с контролем, экстракт среднего качества - на 10-15%, неудовлетворительного - на 3-5%.

Дрожжи выращивают по схеме, приведенной для технологической оценки пригодности мелассы для дрожжевого производства (см. с.81).

При проведении анализа используют в обоих случаях одну и ту же мелассу в одинаковом количестве и одни и те же засевные дрожжи.

Исследуемый экстракт в количестве 9 г (6% к перерабатываемой мелассе) вносят в один из опытных сосудов со средой. Качество экстракта оценивают на основании полученной разницы в скорости роста дрожжей в опытном и контрольном аппаратах. Чем выше скорость роста дрожжей в результате добавления кукурузного экстракта, тем лучше его качество как стимулятора роста.

Ортофосфорная кислота

В качестве источника фосфорного питания используется термическая (пищевая) ортофосфорная кислота НРО (ГОСТ 10678-76). Пищевая ортофосфорная кислота марки А - бесцветная жидкость, прозрачная в слое 15-20 мм при рассматривании на белом фоне, содержащая кислоты не менее 73%, мышьяка не более 0,0003%.

Определяется содержание ортофосфорной кислоты, мышьяка.

Определение массовой доли ортофосфорной кислоты. Отбирают около 1 мл кислоты, разбавляют 50 мл дистиллированной воды и титруют 1 н. раствором щелочи, прибавив 3 капли метилового оранжевого.

1 мл 1 н. раствора гидроксида калия соответствует 0,09806 г НРО.

Содержание ортофосфорной кислоты (в %) вычисляют по формуле

,

где - количество 1 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование, мл; - навеска кислоты, г.

Определение мышьяка в пищевой кислоте. Отвешивают 7 г с точностью 0,0001 г кислоты и вносят в сосуд прибора (см. рис.23), прибавляют 20 мл 0,1 н. раствора перманганата и 7 мл 25%-ного раствора серной кислоты. После двухчасового стояния прибавляют 6 мл 10%-ного раствора сернокислого железа и 7 мл 25%-ного раствора серной кислоты. После обесцвечивания и охлаждения раствора поступают так же, как при определении мышьяка в серной кислоте.

Карбамид

Карбамид (мочевина) используется как источник азота. Он представляет собой белые или слабоокрашенные кристаллы или гранулы, содержащие не менее 46% азота по ГОСТ 2081-75*.

______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 2081-92.**;

** На территории Российской Федерации с 01.03.2011 действует ГОСТ 2081-2010. - Примечание изготовителя базы данных.

Массовую долю азота в пересчете на сухое вещество определяют по ГОСТ 20851.1-75, разделу 2 со следующим дополнением: масса навески карбамида должна составлять 1 г, при этом количество серной кислоты должно быть 5 см, формалина - 40 см, титрование проводят 1 н. раствором гидроксида натрия.

Определение содержания сернокислого аммония и диаммонийфосфата в растворах

В дрожжевом производстве готовят 10, 15 и 20%-ные растворы питательных солей (сернокислого аммония или диаммонийфосфата). После каждого приготовления в них определяют концентрацию сухих веществ, по количеству которых можно контролировать содержание сернокислого аммония или диаммонийфосфата в растворе.

Содержание сернокислого аммония и диаммонийфосфата в растворе в процентах можно контролировать путем определения концентрации сухих веществ сахарометром или рефрактометром.

Количество сухих веществ в растворах сернокислого аммония и диаммонийфосфата разной концентрации представлено в табл.11

Таблица 11

Определение азота в растворах сернокислого аммония. Для определения берут 0,5-1 мл раствора в мерную колбу вместимостью 500 мл, в нее добавляют 400 мл воды и 100 мл 33%-ного раствора гидроксида натрия. Затем отгоняют аммиак и ведут расчеты, как это принято при определении азота по Кьельдалю.

Определение азота и фосфора в растворе диаммонийфосфата. Для определения аммиака в растворе диаммонийфосфата берут 1-2 мл раствора, переносят в коническую колбу вместимостью 150 мл, прибавляют 2-3 капли фенолфталеина и нейтрализуют 0,1 н. раствором гидроксида калия до слабо-розового окрашивания. Затем добавляют 10-15 мл нейтрализованного раствора формалина (40%-ного) и вторично титруют 0,1 н. раствором гидроксида калия до появления слабо-розового окрашивания.

Содержание аммиака (в %) определяют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора гидроксида калия, пошедшее на титрование, мл; 0,0017 - количество NH, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидроксида калия; - количество диаммонийфосфата, содержащееся в растворе, взятом на определение, г.

Для определения фосфора в растворах диаммонийфосфата берут 1 мл раствора, разводят в мерной колбе на 500 или 1000 мл в зависимости от концентрации раствора. Затем 1 мл приготовленного раствора берут в пробирку для определения фосфора по методу Бригса.

Рис.23. Прибор для определения мышьяка

При сборке аппарата можно пользоваться и обыкновенной конической колбой вместимостью 100 мл, причем отдельные части аппарата соединяют с помощью корковых пробок со вставленной вниз трубкой Алена указанных выше размеров. Перед использованием прибора в верхнюю часть насадки 2 помещают разрыхленный комочек ваты , смоченный раствором уксуснокислого свинца и отжатый между листами фильтровальной бумаги. Ниже вставляют полоски фильтровальной бумаги или марли , смоченной тем же раствором уксуснокислого свинца и отжатой между листами фильтровальной бумаги. Снизу трубку закрывают сухим разрыхленным комочком ваты . Для фиксации мышьяка в трубку-уловитель 3 помещают полоску бромортутной бумаги .

При проведении анализа в сосуд 1 наливают 50 мл дистиллированной воды, 2-3 капли 10%-ного раствора двухлористого олова и 1 или 2 мл испытуемой кислоты в зависимости от предполагаемого содержания мышьяка. После этого к раствору прибавляют соответственно 3 или 4 мл химически чистой серной кислоты без мышьяка. Затем прибор охлаждают, после этого в прибор бросают около 4 г химически чистого цинка, не содержащего мышьяка, и плотно вставляют заряженную указанным выше способом насадку 2 , а потом трубку-уловитель 3 с вложенной в него бромортутной бумажкой. Насадку закрывают колпачком из темной бумаги и весь прибор ставят в темное место.

Если в материале содержится мышьяк, то бромортутная бумажка окрашивается в зависимости от количества мышьяка в желтый цвет с оттенками до темно-бурого.

Реакцию считают законченной, когда растворится весь цинк. После этого прибор оставляют еще на 30 мин, затем вынимают полоску бромортутной бумаги из насадки 2 и определяют длину пятна*.

________________

* При определении мышьяка можно использовать прибор для определения сульфидов и сульфитов (см. рис.21). При этом в нижний конец трубки помешают кусочек чистой ваты, на которую кладут вату, смоченную уксуснокислым свинцом. Все плотно утрамбовывают стеклянной палочкой. Затем помещают полоску бромортутной бумаги. В верхний конец трубки помещают чистый кусочек ваты.

При использовании бумажных полосок шириной 2,5 мм соотношение между длиной пятен и содержанием мышьяка выражается следующими величинами:

Если при определении массовой доли мышьяка окраска полосок выходит за пределы окраски шкалы, то для испытания берут большее или меньшее количество кислоты.

Массовая доля мышьяка (в %) определяется по формуле

,

где - количество мышьяка, содержащееся в испытуемой кислоте и определяемое сравнением окраски бромортутной бумажки, г; - количество испытуемой кислоты, мл; - относительная плотность испытуемой кислоты.

Пример. На анализ взято 5 мл испытуемой кислоты, относительная плотность серной кислоты 1,84, длина полученного пятна 5 мм, что соответствует 0,0005 мг или 0,000005 г мышьяка. Подставляем полученную величину в формулу и получаем массовую долю мышьяка в исследуемом веществе (в %)

%.

     
Хлористый калий (технический)

Хлористый калий используют как источник калия в случае недостаточного содержания его в мелассе. Следует применять калий I и II сортов, содержащий хлористого калия не менее 95-98%, влаги не более 1%.

Пробу для анализа отбирают при помощи щупа не менее чем из 10 мест, общая масса средней пробы должна быть не менее 5 кг.

Определяется содержание влаги и хлористого калия.

Определение массовой доли влаги. Отвешивают около 10 г испытуемого вещества и сушат до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 105-110 °С.

Содержание влаги (в %) вычисляют по формуле

,

где - масса хлористого калия до высушивания, г; - масса хлористого калия после высушивания, г.

Определение содержания хлористого калия. Для проведения анализа берут 5 г хлористого калия, взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г, переносят в стакан вместимостью 250 мл, добавляют 100-150 мл воды и нагревают до кипения. Раствор фильтруют в мерную колбу вместимостью 500 мл через фильтр "белая лента" диаметром 9 см. Фильтр с нерастворимым в воде остатком промывают водой до отрицательной реакции на ион хлора (проба с раствором азотнокислого серебра), объем раствора доводят водой до метки и тщательно перемешивают.

Из колбы пипеткой отбирают 50 мл раствора в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.

50 мл раствора после второго разбавления отбирают пипеткой в стакан вместимостью 100 мл, прибавляют 1-2 капли индикатора (метиленовый красный) и 10%-ный раствор уксусной кислоты до изменения цвета раствора, нагревают на водяной бане до 40 °С и осаждают тетрафенилборат калия, приливая по каплям при перемешивании 10 мл 3,5%-ного раствора тетрафенилбората натрия.

Раствору с осадком дают отстояться на бане в течение 5 мин, охлаждают в проточной воде до комнатной температуры и осадок отфильтровывают через высушенный до постоянной массы фильтрующий тигель типа ТФ ПОР16. Осадок из стакана переносят на фильтр и промывают небольшими порциями (3-4 мл) промывного раствора, каждый раз отстаивая раствор досуха. Затем осадок промывают три раза по 5 мл холодной водой. Общий расход промывных вод не должен превышать 50 мл. Фильтр с осадком сушат в сушильном шкафу при 120 °С до постоянной массы.

Содержание хлористого калия (в %) вычисляют по формуле

,

где - масса осадка тетрафенилбората калия, г; 0,2081 - коэффициент пересчета K[B(CH)] на KCl; - навеска, г; - содержание влаги, %.

Содержание окиси калия (в %) определяют по формуле

,

где - содержание хлористого калия, %; 0,632 - коэффициент пересчета хлористого калия на окись калия.

Углекислый калий (поташ)

Поташ используют как источник калия при недостатке его в мелассе и для регулирования рН среды в дрожжерастильных аппаратах. Он представляет собой порошок белого цвета, легко растворимый в воде, раствор имеет щелочную реакцию.

Выпускают поташ трех сортов по действующему ГОСТу. Для производственных целей используют поташ I сорта, содержащий углекислого калия не менее 98% (ГОСТ 10690-73). Определяется содержание углекислого калия.

Определение массовой доли углекислого калия. Около 2 г углекислого калия взвешивают с погрешностью до 0,0002 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, приливают 50 мл воды, нагревают до кипения, прибавляют 2-3 капли раствора метилового красного и титруют раствором соляной кислоты до перехода желтой окраски в малиновую.

Содержание углекислого калия (в %) вычисляют по формуле

,

где - навеска углекислого калия, г; - количество 1 н. раствора соляной кислоты, израсходованное на титрование, мл; - содержание натрия в пересчете на NaCO, определенное по п.3.3, ГОСТ 10690-73, %; - потери в массе при промывании, определенные по п.3.9, ГОСТ 10690-73, %; 0,0691 - количество углекислого калия, соответствующее 1 мл 1 н. раствора соляной кислоты, г; 1,3040 - коэффициент пересчета углекислого натрия на углекислый калий.

Магний сернокислый

Сернокислый магний используют как источник магния при недостатке его в мелассе и производственной воде. Сернокислый магний (ГОСТ 4523-77) представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде.

Содержание MgSО·7НО в реактиве должно быть не менее 99%. Содержание мышьяка в препарате допускается не более 0,00004%.

1. Определяют содержание NaOH. В одну колбу добавляют 5 мл 10%-ного раствора хлористого бария, оставляют в покое на 15 мин, после чего содержимое этой колбы титруют 1 н. раствором соляной кислоты в присутствии фенолфталеина до обесцвечивания раствора.

Содержание гидроокиси натрия (в %) определяют по формуле

,

где - содержание гидроксида натрия, %; - количество 1 н. раствора соляной кислоты, затраченное на титрование содержимого первой колбы, мл; 0,040 - количество гидроксида натрия, соответствующее 1 мл 1 н. раствора кислоты, г; - навеска, соответствующая 5 мл приготовленного раствора, т.е. 1 г сухого исходного материала или 2 г исходного жидкого материала, г.

2. Определяют содержание углекислого натрия. Содержимое 2-й колбы титруют 1 н. раствором соляной кислоты в присутствии метилового оранжевого до розового окрашивания раствора.

Содержание NaCO вычисляется по формуле

,

где - содержание углекислого натрия, %; - количество 1 н. раствора соляной кислоты, затраченное на титрование содержимого второй колбы, мл; - количество 1 н. раствора соляной кислоты, затраченное на титрование содержимого первой колбы, мл; - навеска, соответствующая 5 мл приготовленного раствора, т.е. 1 г сухого исходного материала или 2 г исходного жидкого материала, г; 0,053 - количество углекислой соды, соответствующее 1 мл 1 н. раствора кислоты, г.

Пример. Анализируется жидкий каустик. На титрование содержимого 1-й колбы затрачено 20,6 мл 1 н. раствора кислоты, на титрование содержимого 2-й колбы - 23,6 мл 1 н. кислоты.

Содержание NaOH в жидком каустике (в %) будет 4,0-20,6/2=41,2.

Содержание NaCO (в %) составит 5,3(23,6-20,6)/2=7,95.

Формалин технический (ГОСТ 1625-75*)

______________

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 1625-89. - Примечание изготовителя базы данных.

Формалин - раствор формальдегида в воде. Его применяют для дезинфекции трубопроводов в виде 0,5-1%-ных растворов. Для окуривания дрожжерастильных аппаратов газообразным формальдегидом используют реакцию взаимодействия формалина с марганцевокислым калием, при этом выделяется свободный формальдегид в виде газа. Определяется содержание формальдегида.

Для определения массовой доли формальдегида 3-3,5 г формалина взвешивают в колбе с пробкой с погрешностью не более 0,0002 г, приливают 10 мл дистиллированной воды, 2 капли тимолфталеина и нейтрализуют гидроксидом натрия до бледно-голубой окраски.

В другую колбу помещают 75 мл раствора сульфита натрия, добавляют 2 капли тимолфталеина и нейтрализуют 0,1 н. раствором соляной кислоты до исчезновения голубой окраски или раствором гидроксида натрия до бледно-голубой окраски.

Нейтральный раствор сульфита натрия переливают в колбу с навеской, перемешивают в течение 2 мин и титруют 1 н. раствором соляной кислоты до исчезновения голубой окраски.

Содержание формальдегида в формалине (в %) вычисляют по формуле

,

где - количество 1 н. раствора соляной кислоты, израсходованное на титрование выделившегося гидроксида натрия, мл; 0,03003 - количество формальдегида, соответствующее 1 мл 1 н. раствора соляной кислоты, г; - масса анализируемой пробы, г.

Известь строительная ( ГОСТ 9179-77)

Известь свежегашеную или в виде известкового молока используют для дезинфекции помещений. В свежегашеной извести может содержаться до 85% СаО. Определяют содержание СаО.

Взвешивают около 1 г извести с точностью до 0,001 г. Навеску без потерь переносят в коническую колбу и наливают 25 мл горячей дистиллированной воды. Колбу закрывают резиновой пробкой и оставляют на 30 мин, после чего, добавив 2-3 капли раствора фенолфталеина, титруют содержимое кислотой до стойкого исчезновения розового окрашивания.

Количество окиси кальция (в %) рассчитывают по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора кислоты, затраченное на титрование, мл; - навеска извести, г; 0,028 - количество окиси кальция, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора кислоты, г.

Пример. Навеска извести, взятая на определение, 0,9764 г; на титрование израсходовано 29,2 мл 0,1 н. серной кислоты.

.

Жирные кислоты
олеиновая	86-89,3
линолевая	181,16
Масло
подсолнечное	125-135
хлопковое	101-117
льняное	168-176
конопляное	140-158
репейное	94-106

Номер пробирки	Количество основного раствора, мл	Количество воды, мл	Общий объем, мл	Содержание глюкозы в пробе, мкг
1	7,5	0	7,5	500
2	4,5	3	7,5	300
3	3,0	4,5	7,5	200
4	1,5	6,0	7,5	100
5	0,75	6,75	7,5	50

Рис.24. Эбулиостат

Эбулиостат состоит из двух сосудов: внешнего 1 (обычная коническая колба вместимостью 1 л) и внутреннего 2 , представляющего собой широкую пробирку, суженную вверху и имеющую внутри трубку 3 для пара, один конец которой впаян вверху боковой стенки сосуда 2 , а второй остается свободным и доходит почти до дна сосуда 2 . Верхнее отверстие эбулиостата 7 во время титрования закрывают пробкой 8 , для выхода пара имеется маленькое отверстие 9 на боковой стенке верхней узкой части эбулиостата.

Ход определения заключается в следующем. Во внешний сосуд 1 эбулиостата наливают воду и ставят его на нагревательный прибор. Когда вода закипит, вынимают внутренний сосуд 2 , который соединяется с сосудом 1 пробкой 6 ; наливают в него по 5 мл первого и второго растворов (см. приложение II), медленно вставляют его обратно в сосуд 1 с кипящей водой и закрывают верхнее отверстие эбулиостата пробкой 8 , надетой на кончик бюретки 5 с анализируемым раствором, содержащим сахар. Медно-щелочный раствор в сосуде 2 нагревается до 98 °С в течение 30-40 с, как только пар начнет проходить через медно-щелочный раствор со скоростью 3-4 пузырька в секунду. Если пар долго не проходит через внутренний сосуд 2 , надо уменьшить выход его из сосуда 1 через отводную трубку, подвинтив зажим 4 на трубке. При титровании следят за тем, чтобы вследствие очень быстрого приливания холодного раствора сахара не прекратилось прохождение пара через реагирующую жидкость в сосуде 2 . В случае прекращения видимого кипения жидкости в сосуде 2 уменьшают скорость приливания сахарного раствора из бюретки 5 .

Если концентрация сахара приблизительно известна, то приливают сначала около 80% того количества раствора, которое должно идти на титрование, затем ждут 2 мин (по песочным часам) и дотитровывают, прибавляя раствор сахара со скоростью 1 капля в 5-6 с. Увеличение скорости приливания последних капель приводит к заниженным результатам анализа. Появление желтой окраски жидкости после прибавления одной капли испытуемого раствора указывает на конец титрования.

Если концентрация сахара в анализируемой пробе неизвестна, то предварительно делают ориентировочное определение.

Концентрацию редуцирующих веществ в анализируемом растворе (в %) вычисляют по формуле

,

где - условный титр медного раствора по глюкозе, т.е. количество глюкозы, которое восстанавливает 10 мл медно-щелочного раствора, мг; - количество раствора редуцирующих веществ, пошедшее на титрование, мл.

В жидкостях с концентрацией сахаров менее 0,05% рекомендуется применять обратный порядок титрования. Для этого 1-5 мл анализируемого раствора сахара приливают пипеткой в сосуд 2 непосредственно после добавления первого и второго растворов, а затем, как только пар начнет проходить через реагирующую жидкость в сосуде 2 , ждут 2 мин, после чего дотитровывают из бюретки раствором сахара известной концентрации со скоростью одна капля в 5-6 с до появления желтой или оранжевой окраски. Концентрацию редуцирующих веществ (в %) определяют по формуле

,

где - количество редуцирующих веществ в 1 мл раствора сахара известной концентрации, мг; - количество раствора сахара известной концентрации, пошедшее на дотитрование, мл; - количество исследуемого раствора, мл.

Определение содержания спирта (по Мартену)

Количество спирта в культуральной среде колеблется от 0,01 до 0,09%. Оно может составлять и значительно большие величины, например 1,5%, что зависит от степени аэрации культуральной среды и технологии получения дрожжей.

Спирт определяют по видоизмененному методу Мартена. Сущность метода заключается в окислении спирта смесью двухромовокислого калия с серной кислотой, при этом спирт окисляется до уксусной кислоты и воды.

Избыток двухромовокислого калия (хромпика) оттитровывают раствором соли Мора.

Конец реакции определяют по дифениламину или красной кровяной соли (раствору железосинеродистого калия).

Концентрацию спирта вычисляют по количеству двухромовокислого калия, пошедшему на окисление спирта.

Ход определения заключается в следующем. В низкогорлую круглодонную колбу вместимостью 50 мл (рис.25) наливают 10 мл профильтрованной среды и 0,5 мл 0,1 н. NaOH. В трехшариковый приемник вводят 25 мл раствора двухромовокислого калия (42,6087 г в 1 л), 5 мл серной кислоты относительной плотностью 1,84 и 5 мл ортофосфорной кислоты относительной плотностью 1,66. Приемник помещают в кристаллизатор со льдом. Колбу плотно закрывают резиновой пробкой с отводной трубкой длиной около 50 см, согнутой под углом 45° и суженой на конце. Суженый конец трубки помещают в трехшариковый приемник так, чтобы он почти касался дна приемника. После соединения колбы с приемником содержимое колбы осторожно нагревают и в течение 10-12 мин отгоняют 2/3 ее содержимого, следя за тем, чтобы образующаяся при нагревании пена не попадала в приемник.

Рис.25. Прибор для определения спирта по Мартену:

1 - колба для отгона; 2 - соединительная пробка; 3 - отводная трубка; 4 - трехшариковый приемник; 5 - кристаллизатор со льдом

Жидкость из приемника переливают в колбу с широким горлом вместимостью 750 мл. Отводную трубку и приемник тщательно промывают, промывные воды присоединяют к основной жидкости и доводят объем ее дистиллированной водой приблизительно до 400 мл. После тщательного перемешивания полученную смесь оттитровывают раствором соли Мора с индикатором дифениламином, которого добавляют 5-6 капель. Переход окраски дифениламина в изумрудно-зеленый цвет определяет конец титрования.

Конец реакции можно определить также по раствору красной кровяной соли путем капельной пробы по появлению синего окрашивания от смешивания одной капли титруемой жидкости с одной каплей раствора красной кровяной соли. При этом виде титрования пробы следует брать после каждого прибавления 0,1-0,2 мл раствора соли Мора.

Титр раствора соли Мора определяют перед началом анализа (контрольное титрование).

Из приведенной выше реакции (1) следует, что 1 мл раствора двухромовокислого калия с содержанием 0,0426087 г соответствует 0,0126 мл спирта.

Содержание спирта в среде вычисляют по формуле

,

где - содержание спирта, об. %; - количество двухромовокислого калия, взятое для анализа, мл; - количество соли Мора, пошедшее на титрование испытуемой бражки, мл; - количество соли Мора, пошедшее на контрольное титрование (титр соли Мора), мл; - объем бражки, взятый на определение, мл; 100 - коэффициент перевода, %; 0,0126 - коэффициент перевода KСrО на спирт, мл.

Пример. На определение взято 10 мл бражки и 25 мл KСrО. На контрольное титрование пошло 95 мл раствора соли Мора, а на титрование бражки - 90 мл раствора соли Мора. Определим содержание спирта (об. %)

%.

     
Ускоренный метод определения спирта (ПНР)

Быстрое определение спирта в культуральной среде позволяет оптимизировать процесс выращивания дрожжей.

Сущность метода, разработанного Э.Собчаком (ПНР), заключается в том, что горячий спирт пропускают через раствор двухромовокислого калия, подкисленного серной кислотой.

Избыток двухромовокислого калия после добавления йодистого калия определяют титрованием выделенного йода 1 н. раствором гипосульфита. Индикатором служит 0,4%-ный раствор крахмала.

;

.

По расходу раствора гипосульфита при помощи табл.3 (см. приложение IV) определяют содержание спирта.

Ход определения заключается в следующем. В колбу 1 (рис.26) наливают 20 мл дистиллированной воды, а в приемник пипеткой вносят 10 мл раствора KСrO (42,59 г на 1 л) и 10 мл раствора HSO (относительной плотностью 1,84), разбавленные 1:1. Затем колбу 1 соединяют с приемником 2 стеклянной трубкой так, чтобы конец погруженной трубки находился почти над самым дном приемника с двухромовокислым калием. Затем колбу с водой медленно подогревают до кипения. Пар проходит через стеклянную трубку и конденсируется. Конденсат стекает в раствор двухромовокислого калия и нагревает его (наружу выходят пузырьки воздуха и водяного пара). Началом отгонки спирта считается момент закипания раствора двухромовокислого калия в приемнике, она продолжается 1-3 мин. Затем кипение прерывают, вынимают пробку из колбы для отгонки так, чтобы двухромовокислый калий, находящийся в приемнике, не был втянут в колбу. Содержимое приемника переносят количественно в коническую колбу с притертой пробкой, многократно ополаскивая небольшими порциями дистиллированной воды пробирку и трубку перегонной установки. Общий объем двухромовокислого калия вместе с водой, израсходованной на перенос раствора, должен составлять 50-70 мл.

Рис.26. Прибор для определения спирта ускоренным методом (ПНР)

Затем в коническую колбу добавляют 5 мл 10%-ного раствора йодистого калия, закрывают притертой пробкой и выдерживают в течение 2 мин. После этого содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и добавляют 2 мл 0,4%-ного раствора крахмала. Хорошо перемешанную пробу титруют 1 н. раствором гипосульфита (248,2 г NaSO·5НО на 1 л).

При проведении таким образом глухого опыта (с двумя повторностями) на титрование выделенного йода обычно расходуется 8-9 мл раствора гипосульфита. Затем определяют количество спирта. Если концентрация его выше 1%, то раствор разбавляют водой. При выращивании хлебопекарных дрожжей содержание этилового спирта в культуральной среде определяют (с двумя повторностями) так же, как и при проведении глухого опыта, с той лишь разницей, что в перегонную колбу вносят 10 мл исследуемого раствора и 10 мл дистиллированной воды. По разнице гипосульфита, израсходованного на титрование йода в глухом опыте () и в исследуемом образце (), по табл.3 (см. приложение IV) находят содержание в нем спирта.

Пример. При проведении глухого опыта израсходовано 8,3 мл гипосульфита, а при определении спирта в исследуемой пробе - 7,6 мл. Разница в расходе гипосульфита составит 8,3-7,6=0,7 мл. Этой разнице и расходу гипосульфита в глухом опыте (8,3 мл) в табл.3 (см. приложение IV) соответствует 0,11% спирта, содержащегося в культуральной среде.

Определение содержания растворенного в среде кислорода

В дрожжевой клетке ферментативные процессы могут быть направлены либо на образование спирта, либо на накопление биомассы, что обусловлено количеством растворенного кислорода в среде. При недостатке кислорода в среде одновременно протекают оба процесса. Экономический коэффициент использования сырья при этом понижается и тем сильнее, чем меньше кислорода получают дрожжевые клетки.

Потребность дрожжевых клеток в кислороде зависит от ряда факторов, которые изучаются в настоящее время. Известно только, что потребность в кислороде зависит от энергетических материалов, возраста клеток, условий формирования их дыхательной системы. И.П.Астаховой показано, что для образования 1 г молодых растущих клеток требуется 80-100 г кислорода в час, а более старых - 40-60 мг О/ч. По данным К.П.Андреева, потребность дрожжей в кислороде составляет 0,76-0,78 кг/кг. Известно также, что понижение концентрации кислорода в среде до 1 мг/л почти прекращает размножение дрожжевых клеток. По данным отечественных и зарубежных исследователей, активный процесс роста и размножения дрожжевых клеток наблюдается при концентрации кислорода в среде 2 мг/л.

Для определения растворенного в среде кислорода чаще применяют видоизмененный метод Винклера. Метод основан на ряде химических реакций. Сначала протекает реакция между NaOH и MnCl с образованием осадка гидрата закиси марганца.

.

Затем, если в исследуемой жидкости содержится кислород, часть гидрата закиси марганца окисляется в гидрат окиси.

.

В среде образуется смесь гидратов закиси и окиси марганца, которые, реагируя с соляной или серной кислотой, образуют двух- и треххлористый марганец:

;

.

Треххлористый марганец в присутствии кислорода легко выделяет Сl, который разлагает йодистый калий.

.

Выделившийся йод оттитровывают 0,01 н. раствором серноватисто-кислого натрия, по которому определяют количество растворенного в среде кислорода.

При содержании в воде большого количества органических веществ возможно связывание ими йода, вследствие чего получаются искаженные результаты, вплоть до отрицательных. В связи с этим устанавливают величину поправки на связывание йода веществами среды. Для этого ставят контрольную пробу.

Ход определения заключается в следующем. Пробы исследуемой жидкости для определения кислорода берут в две склянки вместимостью 150-300 мл с хорошо пришлифованными стеклянными пробками. Вместимость склянок точно определяют взвешиванием или предварительным калиброванием. Для каждого определения берут две склянки равного объема и наливают в них по 15 мл 0,1 н. раствора йода и по 3 мл раствора NaOH с KI. Затем в одну из склянок (контрольную) осторожно по стенке наливают исследуемую жидкость и закрывают, не оставляя ни одного пузырька воздуха; во вторую склянку наливают исследуемую жидкость и 2 мл раствора МnСl и склянку осторожно закрывают так, чтобы под пробкой не образовались пузырьки воздуха. Закрытую склянку хорошо перемешивают, переворачивая ее, до образования хлопьевидного осадка. Образовавшемуся осадку гидрата окиси и закиси марганца дают осесть как в опытной, так и контрольной склянке, в течение 30 мин. Затем склянки открывают, прозрачный раствор над осадком сливают с помощью сифона в конические колбы вместимостью по 500 мл. В склянки наливают по 5 мл разбавленной соляной или серной кислоты (2:3) и хорошо взбалтывают до полного растворения осадка. Раствор из склянок сливают в колбы; склянки ополаскивают дистиллированной водой, которую присоединяют к содержимому конических колб.

Весь раствор основного и контрольного опытов в присутствии крахмала титруют серноватистокислым натрием до исчезновения синей окраски; 1 мл 0,01 н. раствора гипосульфита соответствует 0,08 мг кислорода.

Количество кислорода , содержащееся в 1 л исследуемой жидкости в массовых единицах, рассчитывают по формуле

,

где ; - количество 0,01 н. раствора NаSO, пошедшее на титрование в основном опыте, мл; - количество 0,01 н. раствора NaSО, пошедшее на титрование в контрольной пробе, мл; - вместимость склянки, мл; - количество реактивов, введенное в склянку, мл.

Определение скорости роста дрожжей

Скорость размножения дрожжей при их выращивании на мелассовых средах может колебаться в широких пределах (от 0,05 до 0,371), что зависит как от физиологического состояния клеток, так и условий их культивирования.

Интенсивность накопления биомассы характеризуется скоростью роста и скоростью размножения. Скорость роста указывает на увеличение массы клеток, а скорость размножения - частоту их почкования. Для оценки процесса роста часто пользуются средней скоростью роста , под которой понимают количество биомассы, накопившей за определенный промежуток времени. Ее вычисляют по формуле

,

где - количество дрожжей в начале процесса; - в конце промежутка времени .

Дрожжи - это биологический материал, в котором клетки различаются как по возрасту и величине, так и по физиологическому состоянию. В этой связи обычно пользуются понятием "относительная" (удельная) скорость роста , определяемая по формуле

,

где - количество дрожжей в начале процесса, кг; - количество дрожжей, полученных за время , кг.

Пример. Для воздушно-проточного способа культивирования дрожжей

I. Накопительная стадия

- 1100 кг - количество дрожжей, засеянных в дрожжерастильный аппарат;

- 3400 кг - получено дрожжей в конце накопительного периода;

- 7 ч - длительность накопительного периода.

.

Логарифм 3,09=1,1282, его находим по таблице натуральных логарифмов.

II. Стадия непрерывного роста дрожжей

- 4000 кг - получено дрожжей в конце определенного часа наблюдения;

- 3400 кг - было дрожжей в начале этого часа;

- 1 ч.

.

Для характеристики процесса роста и размножения дрожжей часто пользуются коэффициентом часового прироста биомассы , который показывает, во сколько раз биомасса увеличилась в течение 1 ч. Если обозначить количество биомассы в начале процесса через количество биомассы, полученное через 1 ч , через 2 ч , через 3 ч и т.д., то коэффициент часового прироста биомассы выразится следующим образом:

; ; и т.д.

Пример. В дрожжерастильный аппарат засеяли 1000 кг дрожжей. Через час количество биомассы составило 1160 кг. При этом коэффициент часового прироста дрожжей составит =1160/1000=1,16, а удельная скорость роста .

находим по таблице натуральных логарифмов.

Определение содержания нитритов

Нитритообразующие бактерии приносят большой вред размножению дрожжевых клеток. В процессе своей жизнедеятельности они восстанавливают нитраты (соли азотной кислоты) в нитриты (соли азотистой кислоты), которые являются ядом для дрожжевых клеток. По данным Е.А.Плевако, при концентрации нитритов 0,0005% наблюдается задержка роста дрожжей, а при концентрации более 0,004% клетки отмирают, причем в первую очередь погибают почки и молодые, только отпочковавшиеся клетки.

Определение содержания нитритов в культуральной среде и дрожжевом молоке проводят по методике, разработанной в ХО ВНИИХП. Предварительно наличие нитритов устанавливают качественной пробой с реактивом Грисса.

Количественное определение нитритов с помощью фотоэлектроколориметра (ХО ВНИИХП). При оценке содержания нитритов в среде в процессе размножения дрожжей на разных стадиях их производства, в среде или дрожжевом молоке "много"-"очень много", в мерную колбу вместимостью 100 мл отбирают 1-4 мл испытуемого раствора, добавляют 0,5-1 г активного угля, доводят до метки дистиллированной водой, хорошо перемешивают, выдерживают 5-10 мин и фильтруют через плотный фильтр (если среда не очень темная, осветление активированным углем необязательно).

Рис.27. Принципиальная схема прибора для определения степени промывки дрожжей

10 г прессованных дрожжей отвешивают на технохимических весах. В фарфоровой чашке или стакане готовят суспензию с 50 мл дистиллированной воды и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение нескольких секунд.

Кислотность дрожжей (в мг уксусной кислоты) рассчитывают по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора щелочи, пошедшее на нейтрализацию, мл; 6 - количество мг уксусной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора щелочи.

Примечание. При вычислении результатов анализа доли до 0,5 отбрасывают, а доли, равные 0,5 и выше, округляют до единицы.

Кислотность хороших дрожжей обычно находится в пределах 60-120 мг уксусной кислоты на 100 г прессованных дрожжей.

Пример. На титрование 10 г прессованных дрожжей затрачено 2,0 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия, что соответствует 2,0·6·100/10=120 мг уксусной кислоты на 100 г дрожжей.

Определение стойкости дрожжей

По этому показателю определяют сохраняемость прессованной продукции.

Определение стойкости дрожжей при хранении в холодильнике. От каждой партии дрожжей одной даты выработки в этот день отбирают бруски дрожжей, укладывают в применяемую для отправки тару и помещают в холодильную камеру с температурой 0+4 °С. На этикетке бруска дрожжей отмечают час и дату начала хранения. За пробой ведут наблюдение 10 сут, в течение этого срока ежедневно отмечают в журнале органолептические показатели дрожжей. Через 10 сут хранения определяют кислотность дрожжей и результаты анализа записывают в лабораторном журнале. Согласно требованиям ГОСТа на дрожжи они должны выдержать хранение в течение 10 сут.

Определение стойкости дрожжей при хранении в термостате (ускоренный метод). Завернутый в бумагу брусок дрожжей массой 0,5 или 1 кг, предварительно охлажденный до +4 °С, помещают в негерметизированный термостат при 35 °С и хранят до полного размягчения. Время в часах, прошедшее от момента помещения дрожжей в термостат до их размягчения, характеризует стойкость дрожжей.

Стойкие при хранении дрожжи в этих условиях сохраняются более 100 ч и высыхают. Иногда дрожжи размягчаются через 40 ч и ранее, такие дрожжи считаются непригодными для дальнейших перевозок. Согласно ГОСТ 171-81 стойкость дрожжей должна быть не менее 60 ч.

Определение стойкости дрожжей по изменению их подъемной силы (ускоренный метод). О стойкости дрожжей также можно судить по изменению подъемной силы дрожжей, определяемой одновременно в дрожжах, хранившихся в термостате и холодильнике.

Ход определения заключается в следующем. Берут две навески дрожжей по 5 г и помещают в маленькие тигли, один ставят в термостат на 24 ч при 35 °С (требуется точно соблюдать температуру и продолжительность хранения), другой - в холодильную камеру (контроль). По истечении этого срока дрожжи вынимают из тиглей и определяют подъемную силу. Стойкость определяют по разности подъемной силы дрожжей, хранившихся в термостате и холодильнике. Стойкость дрожжей считается хорошей, если подъемная сила ухудшается не более 20 мин.

Определение содержания общего азота в дрожжах

Дрожжи содержат различное количество азота, что характеризуется стадией их культивирования. Так, при получении дрожжей чистой культуры на первых двух стадиях в дрожжах содержится 2,8% азота, на третьей - 2,6%, на четвертой - 2,5%. Дрожжи ЕЧК в первой стадии обычно содержат 2,4% азота, во второй - 2%. Товарные дрожжи на первой стадии (Б) содержат 1,9% азота, а на второй стадии (В) - 1,6-1,8%. Причем дрожжи, предназначенные для сушки, обычно содержат не более 1,6% азота, а предназначенные для упаковки - 1,8%.

Анализируют каждую партию дрожжей. Общий азот в прессованных дрожжах определяют по методу Кьельдаля.

Ход определения. Около 4 г прессованных дрожжей отвешивают в бюксе на аналитических весах с точностью до четвертого знака и переносят в колбу Кьельдаля. Остаток дрожжей в бюксе взвешивают и по разности определяют массу взятой навески. В колбу наливают 20 мл концентрированной, химически чистой серной кислоты, добавляют 2-3 крупинки селена или около 1 г сернокислой меди и около 10 г сернокислого калия (катализаторы). Если в дальнейшем в этой же навеске дрожжей определяют и фосфор, сжигание с медью производить нельзя.

Сжигание дрожжей и отгонку азота проводят так же, как и при определении общего азота в мелассе. Если параллельно с определением азота определяют фосфор, то из мерной колбы сначала отбирают 50 мл для этого определения, а остальной раствор переводят в колбу для отгона аммиака.

Содержание азота (в %) вычисляют по формуле

,

где - количество 0,1 н. раствора серной кислоты, налитое в приемник, мл; - количество 0,1 н. раствора щелочи, затраченное на титрование, мл; - навеска дрожжей, г; 0,0014 - коэффициент перевода миллилитров серной кислоты в граммы азота (1 мл 0,1 н. раствора серной кислоты соответствует 0,0014 г азота).

Общее количество белка вычисляют путем умножения количества общего азота на коэффициент 6,25.

Пример. Для анализа взято 4,8200 г дрожжей. Для определения фосфора отобрана 1/5 часть, что составляет 4,8200/5=0,964 г. Для определения азота взято 4,8200-0,964=3,8560 г. В приемник налито 75 мл 0,1 н. раствора серной кислоты. На титрование оставшейся свободной кислоты затрачено 22,4 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Аммиаком связано 75-22,4=52,6 мл кислоты. Следовательно, содержание азота в дрожжах составит

%.

     
Определение содержания фосфора

Содержание фосфора в дрожжах, как и азота, зависит от стадии их культивирования. В первых трех стадиях при получении чистой культуры в дрожжах содержится 1,4% РО, в четвертой - 1,3% РО. В дрожжах ЕЧК на первой стадии содержится 1,2% РО, а на второй - 1,0% РО. Товарные дрожжи на стадии Б содержат 0,9% РО, а на стадии В - 0,8% РО. Фосфорный ангидрид в дрожжах определяют колориметрическим методом Бригса или при помощи фотоэлектроколориметра.

Метод Бригса. Принцип метода основан на образовании фосфорномолибденовой кислоты и ее восстановлении гидрохинином и NaSO с образованием устойчивой синей окраски. Интенсивность окраски возрастает пропорционально количеству неорганического фосфора в испытуемой пробе.

Ход определения. Навеску прессованных дрожжей около 1 г помещают в колбу Кьельдаля и сжигают так же, как это указано при определении общего азота. После сжигания содержимое колбы переводят в мерную колбу вместимостью 100 мл. Колбу Кьельдаля несколько раз ополаскивают водой, которую также сливают в мерную колбу во избежание потерь. Затем содержимое колбы доводят дистиллированной водой приблизительно до половины объема мерной колбы, нейтрализуют 33%-ным раствором гидроксида натрия, охлаждают, доливают дистиллированной водой до метки и хорошо перемешивают. Из мерной колбы отбирают 1 мл в пробирку высотой 70 мм и диаметром 15 мм.

Одновременно в семи других пробирках такого же размера готовят стандартный ряд со все увеличивающимися концентрациями фосфора: 0,01; 0,02, 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07 мг фосфора в 1 мл. Для этого в первую из семи пробирок наливают 0,1 мл стандартного раствора KHPO, что соответствует 0,01 мг фосфора: во вторую - 0,2 мг, т.е. 0,02 мг фосфора; в третью - 0,3; в четвертую - 0,4, в пятую - 0,5; в шестую - 0,6; седьмую - 0,7 мл. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду: в первую 0,9 мл, во вторую 0,8, в третью 0,7, в четвертую 0,6, в пятую 0,5, в шестую 0,4, в седьмую 0,3 мл. Таким образом, в каждой из семи пробирок объем жидкости составляет 1 мл.

Затем в каждую из восьми пробирок (семь стандартного ряда и одна с испытуемым раствором) наливают по 1 мл молибденового раствора, по 1 мл раствора гидрохинона и по 1 мл раствора безводного сульфита и хорошо взбалтывают, после чего содержимое пробирок окрашивается в синий цвет различной интенсивности - от светло-синего до темно-синего. Пробирки оставляют в покое на 20 мин, после чего быстро сравнивают окраску пробирки с испытуемой жидкостью с окраской каждой из семи пробирок стандартного раствора.

Содержимое фосфора (в %) рассчитывают по формуле

,

где - содержание фосфора в пробирке с испытуемым веществом (по стандартному ряду), мг; - разведение; - масса дрожжей в пересчете на 25% СВ, г; 2,29 - коэффициент перевода в РО (частное от деления молекулярной массы РО на молекулярную массу фосфора 142/62=2,29); 100 - пересчет на проценты; 1000 - перевод в граммы.

Пример. На определение взят 1 г прессованных дрожжей с содержанием 25% СВ. После сжигания в колбе Кьельдаля все содержимое перенесено в мерную колбу на 100 мл. На определение фосфора взят 1 мл раствора. После сравнения окраски испытуемого раствора с цветом растворов стандартного ряда установили, что цвет пробирки с испытуемым раствором соответствует цвету пробирки стандартного ряда, содержащей 0,04 мг фосфора.

Содержание PO в прессованных дрожжах составит

%.

Уточненный метод Фиске и Сабуро (ХО ВНИИХП). Метод Фиске и Сабуро широко распространен в аналитической практике. Для упрощения этого метода введен ряд изменений. В качестве восстановителя вместо эйконогена принята аскорбиновая кислота, устранен подогрев при 37 °С, общий объем всех растворов составляет 5 мл, а не 50. Интенсивность окраски устанавливают визуально или на фотоэлектроколориметре.

При визуальном способе определение интенсивности синей окраски устанавливают сопоставлением окраски испытуемого раствора с окраской ряда пробирок стандартного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия (KНРО) с содержанием от 0,01 до 0,08 мг фосфора.

При определении интенсивности окрашивания растворов на фотоэлектроколориметре сначала строят калибровочный график. Для этого готовят пробирки стандартного ряда и каждую из них колориметрируют, определяя оптическую плотность раствора. На оси абсцисс откладывают количество фосфора в миллиграммах, на оси ординат - соответствующую ему оптическую плотность.

Содержание фосфора в дрожжах выражают в пересчете на фосфорный ангидрид РО (в %).

Подготовку дрожжей и ход определения проводят следующим образом. В прессованных или сушеных дрожжах содержание общего фосфора определяют после минерализации дрожжей, т.е. в виде неорганического фосфора. Для этого дрожжи измельчают на сите, отвешивают в стаканчик на аналитических весах около 2 г, переносят их в колбу Кьельдаля вместимостью 100 мл, добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и озоляют. Катализатором при озолении служит 30%-ный пергидроль. Его осторожно несколько раз добавляют по 2-3 мл, предварительно охладив колбы Кьельдаля.

После полного обесцвечивания раствора колбу Кьельдаля смывают 5-8 мл воды и продолжают нагрев до появления белых паров (для полного удаления перекиси водорода). Затем колбу Кьельдаля охлаждают и раствор количественно переводят в мерную колбу вместимостью 100 мл, охлаждают до 20° С, доводят до метки и перемешивают.

Для дальнейшего определения фосфора требуется тщательная нейтрализация раствора. Так как добавка индикатора при нейтрализации может в дальнейшем влиять на оттенок синей окраски, в отдельной порции устанавливают количество щелочи, расходуемой на нейтрализацию. Для этого пипеткой отбирают в колбу 5 мл раствора и оттитровывают его по метиловому красному 10%-ным раствором NaOH.

Затем в мерную колбу на 50 мл отбирают пипеткой 25 мл кислого раствора озоленных дрожжей и добавляют пятикратное количество щелочи, пошедшее на нейтрализацию 5 мл этого раствора. После этого колбу охлаждают до 20° С, доводят до метки водой и хорошо перемешивают.

При нейтрализации нужно следить за тем, чтобы не было излишка щелочи, так как это вызывает появление мути.

Определение на фотоэлектроколориметре. В пробирку отбирают 1 мл отнейтрализованного раствора озоленных дрожжей, добавляют 2 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора молибденовокислого аммония, тщательно взбалтывают, добавляют 1 мл 0,2%-ного раствора аскорбиновой кислоты, опять взбалтывают и выдерживают 20 мин при 20 °С. Общий объем жидкости в пробирке составляет 5 мл. Спустя 20 мин определяют на ФЭК оптическую плотность раствора в кюветах с расстоянием между гранями 5 мм при красном светофильтре. В кювету сравнения наливают дистиллированную воду. По калибровочному графику и найденной оптической плотности находят по оси абсцисс количество фосфора в миллиграммах.

При отсутствии ФЭК содержание фосфора определяют визуально.

Визуальный способ. Отбирают 8-10 пробирок одинакового диаметра и объема и готовят в них стандартный ряд с увеличивающимся количеством фосфора: от 0,01 до 0,06 мг. Для этого в первую пробирку из колбы с 50 мл стандартного раствора KНРО отбирают 0,1 мл, что соответствует 0,01 мг фосфора, во вторую - 0,2 мл, т.е. 0,02 мг фосфора, и т.д., в шестую - 0,6 мл, т.е. 0,06 мг фосфора.

В первую пробирку добавляют 0,9 мл дистиллированной воды и в последующие - соответственно от 0,8 до 0,4 мл. Таким образом, в каждой пробирке находится 1 мл. Затем в отдельную пробирку из мерной колбы с 50 мл испытуемого нейтрального раствора озоленных дрожжей отбирают 1 мл. В каждую пробирку со стандартным и испытуемым раствором добавляют 2 мл дистиллированной воды и по 1 мл молибдата аммония, взбалтывают, выдерживают 20 мин при 20° С, после чего устанавливают, с какой пробиркой стандартного ряда совпадает синяя окраска испытуемого раствора с дрожжами.

Для большей точности определения фосфора визуальным способом можно взять 10-12 пробирок и отобрать в первую 0,1 мл раствора KНРО, что соответствует 0,01 мг фосфора, во вторую - 0,15 мл, т.е. 0,015 мг фосфора, и т.д., т.е. в четвертую - 0,25 мл, или 0,025 мг фосфора, и в десятую - 0,55 мл, т.е. 0,055 мг фосфора.

Дистиллированной воды следует добавить в каждую пробирку до объема 1 мл, т.е. в первую 0,9 мл, во вторую 0,85, в четвертую 0,75 и в десятую 0,45 мл воды.

100 г дрожжей -

=12,0% трегалозы.

Содержание трегалозы в пересчете на абсолютно сухое вещество:

25 г химически чистого йодистого калия растворяют в возможно малом количестве воды в мерной колбе вместимостью 1 л, прибавляют 12,7 г йода, очищенного возгонкой, и взбалтывают до полного растворения его, после чего доводят раствор до метки. Раствор сохраняют в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой. Титр устанавливают по гипосульфиту, для чего 20 мл раствора йода титруют 0,1 н. раствором гипосульфита до тех пор, пока цвет раствора не станет светло-желтым, затем прибавляют 2-3 капли раствора крахмала и дотитровывают до полного обесцвечивания раствора.

Пример. 20 мл йодного раствора эквивалентны 21,3 мл 0,1 н. раствора NaSO с поправкой гипосульфита 0,98, что соответствует 21,3·0,98=20,87 мл точно 0,1 н. раствора. 20 мл раствора йода соответствуют 20,87 мл 0,1 н. раствора гипосульфита. Поправка раствора йода составит 20,87/20=1,0435.

0,1 н. раствор уксусной кислоты. Грамм-эквивалент СНСООН равен 60,03; для приготовления 0,1 н. раствора следует взять 60,03/10=6,003 г уксусной кислоты.

Из концентрированной кислоты в зависимости от процентного содержания в ней СНСООН готовят 0,1 н. раствор.

Пример. Имеется 80%-ный раствор уксусной кислоты; для приготовления 0,1 н. раствора нужно взять 6·100/80=7,5 г кислоты

Принимая плотность уксусной кислоты за 1, отмериваем 7,5 мл и доводим их дистиллированной водой до объема 1 л.

0,1 н. раствор двухромовокислого калия. Для приготовления 1 н. раствора двухромовокислого калия величину навески находят из уравнения

.

Одна молекула KСrО соответствует 6 атомам йода, поэтому нормальный раствор должен содержать в 1 л 294,21/6=49,035 г KСrО.

Для приготовления 0,1 н. раствора KСrО берут навеску 4,9035 г KСrО, перекристаллизованного и высушенного до постоянной массы при 120-130 °С, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. В 1 мл раствора содержится 4,9035 г KСrО, что соответствует 12,69 мг йода или 0,8 мл кислорода.

Приготовление буферных растворов

Тетраборнокислый натрий NaBO·10НО (бура). Подготовка вещества. 100 г препарата растворяют в 550 мл воды при температуре 50-60 °С (при более высокой температуре кристаллизуется NaBO·5НО). Растворы фильтруют и охлаждают до 25-30 °С. При последующем энергичном помешивании раствора происходит кристаллизация буры. Образующиеся кристаллы отфильтровывают через отсасывающую воронку, снова подвергают растворению и кристаллизации. Затем кристаллы сушат между листами фильтровальной бумаги до тех пор, пока они не перестанут прилипать к стеклянной палочке.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,05 М раствора тетра-борнокислого натрия 19,10 г полученного препарата растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 1 л.

Янтарная кислота СНО. Подготовка вещества. 100 г препарата растворяют при кипячении в 165 мл воды, раствор фильтруют через воронку с обогревом, фильтрат постоянно помешивают, после охлаждения раствора кристаллы отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова подвергают растворению и кристаллизации. Затем кристаллы сушат между листами фильтровальной бумаги до тех пор, пока они не перестанут прилипать к стеклянной палочке.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,05 М раствора янтарной кислоты 5,90 г полученного препарата растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 1 л.

Калийбифталат СНОK. Подготовка вещества. 50 г препарата растворяют в 100 мл воды, кристаллизацию ведут при температуре не ниже 25 °С, так как при более низкой температуре образуются кристаллы трифталата калия - более кислой соли. Полученные кристаллы сушат до постоянной массы при температуре 110-115 °С.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,2 М раствора бифталата калия 40,84 г полученного препарата растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Калий хлористый KCl. Подготовка вещества. Препарат ч.д.а. 3-4 раза перекристаллизовывают из воды. 350 г препарата растворяют в 650 мл воды, раствор нагревают до кипения, фильтруют и охлаждают до 25 °С, при охлаждении из раствора выпадает около 100 г хлористого калия. Кристаллы сушат в течение 48 ч при температуре 115-120 °С.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,2 М раствора хлористого калия 14,91 г препарата растворяют в воде и объем препарата доводят водой до 1 л.

Калий фосфорнокислый однозамещенный KНРО. Подготовка вещества. Калий фосфорнокислый однозамещенный 2 раза перекристаллизовывают из воды. 100 г препарата растворяют при кипячении в 150 мл воды. Раствор отфильтровывают на отсасывающей воронке и снова подвергают растворению и кристаллизации. Кристаллы сушат до постоянной массы при температуре 110 °С. Потери полученного препарата при прокаливании составляют 13,23±0,01%.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,1 н. раствора фосфорнокислого калия 13,62 г полученного препарата растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 1 л.

Натрий углекислый безводный NaCO. Подготовка вещества. 40 г препарата нагревают в платиновом тигле на песочной бане при температуре 270-300 °С до постоянной массы Во время нагревания препарат часто перемешивают платиновым шпателем или проволокой (которые оставляют в тигле во время нагревания) и охлаждают в эксикаторе. Полученный безводный углекислый натрий ввиду его гигроскопичности сохраняют в банках с притертыми пробками.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,1 н. раствора углекислого натрия 5,30 г полученного препарата растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Двузамещенный фосфат натрия Na НРО ·12Н О. Подготовка вещества. 150 г двузамещенного двенадцативодного фосфата натрия (х.ч.) NaHPO·12НО дважды перекристаллизовывают из воды. Перекристаллизованный препарат нагревают в фарфоровой чашке на водяной бане при непрерывном перемешивании до полного высыхания препарата. Полученную соль (NaHPO·12НО) высушивают над расплавленным хлористым кальцием до постоянной массы. Потери препарата при прокаливании составляют 25,28±0,01%.

Приготовление раствора. Для приготовления 0,1 н. раствора двузамещенного фосфата натрия 17,81 г полученного препарата растворяют в воде и объем раствора доводят водой до 1 л.

Гидроксид натрия. Подготовка вещества и приготовление раствора. 250 г препарата растворяют в 300 мл воды в стеклянном цилиндре с пробкой. Раствор хорошо перемешивают, закрывают цилиндр пробкой и оставляют в покое на несколько дней, в течение которых углекислый натрий, нерастворимый в щелочи указанной концентрации, оседает на дно цилиндра. После этого главную массу прозрачного раствора сливают и соответствующим разбавлением полученного раствора водой, не содержащей углекислоты, приготовляют растворы гидроксида натрия необходимой концентрации (0,1 н. и 1 н.).

Примечание. Навески препаратов берут с точностью до 0,01 г.

Буферные смеси, применяемые для определения рН. Буферные смеси, применяемые для определения интервала перехода рН от 0,13 до 5,8, приведены в табл.2; для определения интервала перехода рН от 6 до 11 - в табл.3 и для определения интервала перехода рН от 11,2 до 14 - в табл.4.

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Общий объем смеси равен 100 мл. Растворы отмеривают бюреткой.

Индикаторы для определения кислотности и щелочности. Интервал рН перехода окраски индикатора определяют буферными смесями.

Шкала буферных смесей должна быть составлена так, чтобы для индикатора с двумя приведенными в табл.2 значениями перехода можно было отчетливо обнаружить оба перехода, для чего каждому из двух приведенных в этой таблице значений рН предшествуют две буферные смеси, отличающиеся одна от другой на 0,2 рН.

Испытание фенолфталеина проводят в интервале перехода рН от 8,2 до 10, что соответствует изменению окраски от бесцветной к красной.

Первое изменение окраски от бесцветной к красной должно наблюдаться в смеси со значением рН 8,2 (по сравнению со смесями рН 7,8-8) и должно нарастать в смесях с рН 8,4-8,6. Смесь со значением рН 10 должна быть моментом прекращения нарастания интенсивности окраски. Две предшествующие смеси с рН 9,6-9,8 обнаруживают еще усиление окраски; сравнение же с двумя последующими смесями с рН 10,2 и 10,4 обнаруживает прекращение нарастания интенсивности окраски.

Таким образом, для испытаний одноцветных индикаторов шкалы буферных смесей построены то тому же принципу.

Шкала для испытаний фенолфталеина состоит из буферных смесей со следующими значениями рН: 7,8; 8; 8,2; 8,4; 8,6; 9,6; 9,8; 10; 10,2 и 10,4.

Для испытания индикатора метилового фиолетового составляют шкалу буферных смесей, соответствующую значениям рН: 0,13; 0,28; 0,74; 1; 1,4; 1,8; 2,2; 2,6; 3; 3,4.

За изменением окраски ведут наблюдение тотчас же по прибавлении во все пробирки раствора индикатора. Для испытания в интервале рН 3-3,4 необходимо применять бифталатные буферные смеси.

Для приготовления шкалы наливают по 5 мл буферных смесей (соответствующих значениям рН, приведенным в табл.2 с двумя предшествующими и двумя последующими смесями, отличающимися одна от другой на 0,2 рН) в 10 хорошо вымытых, пропаренных, сухих пробирок бесцветного стекла и одинакового диаметра.

Фосфатные буферные смеси. Буферные смеси с концентрацией водородных ионов от 8,3 до 4,5. Приготавливают растворы 1/15 молярных фосфатов.

1 н. раствор азотной кислоты. Берут 67,2 мл (х.ч.) кислоты относительной плотностью 1,4 и разбавляют дистиллированной водой до 1 л.

0,01 н. раствор азотной кислоты. Из имеющегося 1 н. раствора отбирают пипеткой 5 мл, вносят их в мерную колбу на 500 мл, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Растворы для определения суммы кальциевых и магниевых солей

Необходимо иметь следующие реактивы, приготовленные с таким расчетом, чтобы 1 мл трилона Б соответствовал 1 мг СаО.

Раствор трилона Б н./28. Растворяют 6,657 г в 1 л дистиллированной воды.

Раствор хлористого кальция н./28. 1,79 г СаСО, предварительно высушенного в шкафу при 100 °С и охлажденного в эксикаторе (с хлористым кальцием), переносят в колбу вместимостью 1 л с небольшим количеством воды (до 100 мл) и добавляют сразу 2 мл, а затем по каплям концентрированной НСl до окончания выделения пузырьков СО. Когда осадок СаСО полностью растворится, колбу доливают до метки дистиллированной водой и раствор перемешивают. Этот раствор с концентрацией н./28 вместе с раствором MgSO служит для установления титра трилона Б. Магний сернокислый н./28 (4,408 г) растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Раствор индикатора. 0,5 г хромогена-черного (специального ЕТ-00) растворяют в 100 мл аммиачно-буферного раствора и доливают этиловым спиртом до объема 100 мл.

Аммиачно-буферный раствор. Смешивают 100 мл 20%-ного раствора NHCl (химически чистого) с 100 мл 20%-ного аммиака и смесь доливают дистиллированной водой до 1 л.

Боратно-буферный раствор. 40 г химически чистой десятиводной буры (NaBO·10НО) растворяют в 800 мл воды, прибавляют 100 мл 10%-ного гидроксида натрия. Смесь после охлаждения доводят дистиллированной водой до 1 л. Этот раствор следует хранить в склянке, плотно закрытой резиновой пробкой.

Смешанный раствор, содержащий кальций и магний в соотношении 3:1. Раствором, составленным, например, из 300 мл н./28 СаСl и 100 мл н./28 MgSO, титруют 25 мл трилона Б, помещенных в коническую колбочку вместимостью 200-250 мл, куда добавляют также 5 мл аммиачно-буферного раствора и 7-8 капель индикатора. Титрование проводят при энергичном перемешивании до перехода окраски раствора из зеленовато-синего цвета в винно-красный.

Все реактивы, применяемые для определения солей кальция и магния, должны храниться в темном месте.

Растворы для определения магния

0,05 н. раствор трилона Б. Навеску трилона Б 9,3065 г растворяют в дистиллированной воде, фильтруют и доводят водой до 1 л.

Титр трилона Б устанавливают по металлическому цинку (по сернокислому магнию точно установить титр трудно, так как он быстро теряет кристаллизационную воду).

На аналитических весах отвешивают 1,5-2 г чистого металлического цинка, переносят в колбу на 250 мл, обрабатывают 20-30 мл соляной кислоты (1:1) под вытяжкой и слегка нагревают. После растворения цинка раствор количественно переносят в мерную колбу на 1 л, доводят до метки и перемешивают. Нормальность стандартного раствора цинка рассчитывают по формуле

,

где - навеска металлического цинка, г; 32,63 - эквивалентная масса цинка.

Поправку стандартного раствора цинка рассчитывают по формуле

,

где - навеска металлического цинка, г; 1,6342 - эквивалентная масса цинка, соответствующая 0,05 н. раствору.

Для установления нормальности раствора трилона Б отбирают пипеткой 20-25 мл стандартного раствора цинка, доливают дистиллированной водой до 100 мл, нейтрализуют несколькими каплями аммиака до избытка его по запаху, вносят 10 мл аммиачно-буферного раствора, немного сухого хромогена-черного и титруют 0,05 н. раствором трилона Б до перехода окраски индикатора из розового в синий цвет.

Нормальность трилона Б определяют по формуле

,

где - нормальность стандартного раствора цинка; - нормальность трилона Б; - объем стандартного раствора цинка, взятый на титрование, мл; - объем раствора трилона Б, пошедший на титрование, мл.

Соляная кислота 1:1.

0,05 н. раствор сернокислого магния. Навеску сернокислого магния MgSO·7НО в количестве 6,1625 г отвешивают на аналитических весах и растворяют в мерной колбе на 1 л дистиллированной водой.

Аммиачно-буферный раствор. 20 г хлористого аммония (химически чистого) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, добавляют 100 мл 25%-ного раствора аммиака и разбавляют водой до 1 л.

Насыщенный раствор щавелевокислого аммония . Растворяют 5,8 г в 100 мл воды.

Растворы для определения содержания азота аминокислот "медным способом"

Раствор хлорной меди. 27,3 г CuCl·2НО переводят в колбу вместимостью 1 л и вливают дистиллированной воды до метки.

Фосфорнокислый натрий. 64,5 г NaHPO·12НО растворяют в 50 мл воды, свободной от СО, добавляют 7,2 ч NaOH, переводят в колбу вместимостью 1 л и добавляют воды до метки.

Боратный буфер. 57,21 г NaBO·10НО растворяют в 1500 мл воды, добавляют 100 мл 1 н. НСl и доводят раствор дистиллированной водой до 2000 мл.

Нормальный раствор гидроксида натрия (1 н. NaOH).

Уксусная кислота 80%-ная.

Смесь медного фосфата. Для приготовления этой смеси смешивают (по объему) одну часть раствора хлорной меди (реактив 1) с двумя частями тринатрия фосфата (реактив 2), к смеси добавляют две части боратного буфера (реактив 3).

Раствор тимолфталеина. 0,25 г тимолфталеина растворяют в 100 мл 90%-ного спирта.

Сантинормальный раствор гипосульфита. 0,01 н. NaSO·5НО 2,482 г гипосульфита растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Раствор крахмала. Взбалтывают 1 г растворимого крахмала в 5 мл дистиллированной воды; этот раствор маленькими порциями вливают в насыщенный раствор КСl (80 мл) и кипятят 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, переводят в колбу на 100 мл и доводят насыщенным раствором КСI до метки, раствор крахмала должен быть нейтральным (рН 7).

Приготовление нейтральной воды

К определенному количеству прокипяченной дистиллированной воды прибавляют на каждые 100 мл 2-3 капли раствора бромтимола-синего и разбавленного раствора щелочи (приблизительно 0,01 н.) до тех пор, пока вся жидкость не окрасится в голубоватый цвет.

Нейтральную воду необходимо готовить непосредственно перед использованием.

Растворы для определения хлористого калия

Алюминий хлористый ч., 0,5%-ный раствор.

Кислота уксусная х.ч., 1%-ный и 10%-ный растворы.

Тетрафенилборат натрия, 3,5%-ный раствор. Готовят следующим образом. 3,5 г тетрафенилбората натрия растворяют при комнатной температуре в 100 мл воды, приливают 0,5 мл 0,5%-ного раствора хлористого алюминия, перемешивают, после отстаивания в течение ночи в темном месте фильтруют через сухой бумажный фильтр. Первые порции фильтрата приливают обратно к фильтруемому раствору и продолжают фильтрование (применяют свежеприготовленный раствор).

Раствор промывной готовят следующим образом. К 100 мл 1%-ной уксусной кислоты прибавляют 3-4 мл 3,5%-ного раствора тетрафенилбората натрия.

Серебро азотнокислое, 1%-ный раствор.

Метиловый красный (индикатор), 0,1%-ный раствор в 60%-ном этиловом спирте.

Приготовление нейтрального раствора формалина

В колбу из белого стекла наливают 40%-ный раствор формалина, добавляют 2-3 капли индикатора фенолфталеина и осторожно из бюретки по каплям титруют крепким раствором щелочи, например 33%-ным раствором NaOH, до слабо-розового окрашивания, появляющегося от прибавления одной капли щелочи и затем исчезающего.

Формалин можно нейтрализовать и с помощью рН-метра. При этом его нейтрализуют щелочью до рН 8 (точка перехода окраски индикатора фенолфталеина).

Раствор для определения спирта методом окисления до уксусной кислоты (по Мартену)

2. 92 г соли Мора [FeSO(NH)SO·HO] растворяют в воде, к раствору прибавляют 20 г концентрированной серной кислоты относительной плотностью 1,84 и по охлаждении объем доводят до 1 л.

3. Свежеприготовленный раствор железосинеродистого калия 0,1 г KFe(CN) растворяют в 100 мл воды.

Приготовление шкалы эталонов для определения нитритов (окислов азота) по ХО ВНИИХП

Типовой раствор готовят, растворяя 0,1816 г химически чистого азотистокислого натрия в 1 л дистиллированной воды. 10 мл этого раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают дистиллированную воду до метки, 1 мл раствора содержит 0,00001 г NО.

Шкалу эталонов готовят следующим образом: в несколько цилиндров (одинаковых по цвету стекла и размерам) наливают по 25 мл дистиллированной воды и при помощи микробюретки добавляют в первый цилиндр 0,25 мл типового раствора, во второй - 0,5 мл и далее 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл. Затем во все цилиндры прибавляют по 5 мл реактива Грисса. Растворы в цилиндрах тщательно перемешивают и через 10-15 мин сравнивают окраску содержимого с окраской испытуемого раствора.

Реактив Грисса

Этот реактив состоит из двух растворов, хранящихся до момента использования отдельно в темных склянках. Первый раствор: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 30%-ной уксусной кислоты. Второй раствор: 0,1 г нафтиламина кипятят 20 мин в 20 мл воды в колбе с обратным холодильником, затем прибавляют 150 мл 30%-ной уксусной кислоты. Перед использованием оба раствора сливают вместе в равных частях.

Для приготовления реактива Грисса из сухого препарата отвешивают 1 г препарата и растворяют в 50 мл дистиллированной воды.

Приготовление бромортутной бумаги

Исходный препарат бромной ртути предварительно очищают возгонкой, для чего его помещают в фарфоровую чашку или тигель, накрывают часовым стеклом и осторожно нагревают на песчаной бане. Бромная ртуть возгоняется в виде белых игл, а в фарфоровой чашке остается черный осадок. Работа ведется в вытяжном шкафу.

Бромную ртуть можно приготовить в лаборатории: 50-100 г ртути наливают в фарфоровую чашку, обливают дистиллированной водой. Затем по каплям прибавляют к ней бром до тех пор, пока не израсходуется вся металлическая ртуть. Полученный раствор нагревают, фильтруют в горячем состоянии и дают выкристаллизоваться бромной ртути. Снова ее перекристаллизовывают из горячей воды, высушивают при возможно низкой температуре, после чего очищают возгонкой, как указано выше.

Бромортутную бумагу готовят следующим способом: полосы непроклеенной плотной белой бумаги погружают в 5%-ный спиртовой раствор бромной ртути и оставляют стоять 5-10 мин.

Необходимо следить, чтобы раствор покрывал бумагу и не было участков, не погруженных в раствор. Затем полоски вынимают, избыток раствора удаляют путем встряхивания и высушивают в горизонтальном положении на стеклянных палочках. Из высушенной бумаги вырезают полоски длиной 40-50 мм и шириной 2-2,5 мм. Готовые полоски кладут в темную склянку с хорошо притертой пробкой и хранят в темном месте (срок годности не более 3 мес).

Йодно-ртутный раствор для определения йодного числа в олеиновой кислоте

Готовят два раствора: 1) 25 г кристаллического йода в 500 мл 96%-ного этилового спирта; 2) 30 г сулемы в 500 мл 96%-ного спирта. Раствор сулемы фильтруют.

Оба раствора хранят в отдельных склянках из темного стекла с притертыми пробками и смешивают их в равных объемах за 48 ч до начала определения йодного числа.

Растворы для определения фосфора по методу Бригса

5%-ный молибденовый раствор. 25 г молибденовокислого аммония растворяют в 300 мл дистиллированной воды. К полученному раствору добавляют 75 мл концентрированной серной кислоты, предварительно разбавленной в 120 мл воды, затем общий объем раствора доводят водой до объема 500 мл.

Свежеприготовленный 1%-ный раствор гидрохинона. К 100 мл раствора добавляют одну каплю концентрированной серной кислоты для предотвращения окисления.

20%-ный раствор безводного сульфита (NaSO). Вследствие окисления сульфитный раствор портится при стоянии, поэтому пользуются свежеприготовленным раствором.

Стандартный раствор KНРО. Этот раствор готовят из чистой соли, которую предварительно измельчают и высушивают в эксикаторе в течение нескольких дней. 4,394 г соли растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1 л, добавляют в качестве антисептика несколько капель хлороформа. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора. 100 мл этого раствора разбавляют водой до 1 л и получают раствор, в 1 мл которого содержится 0,1 мг фосфора.

Растворы для определения фосфора по уточненному методу Фиске и Сабуро (ХО ВНИИХП)

2,5%-ный раствор молибденовокислого аммония в 3 н. серной кислоте. На технохимических весах отвешивают в стаканчике 2,5 г молибденовокислого аммония, добавляют 5 мл дистиллированной воды, размешивают и добавляют 7,6 мл концентрированной серной кислоты, предварительно разбавленной в отдельной колбочке 30-55 мл воды. Полученный раствор молибдата аммония переводят водой в мерную колбу вместимостью 100 мл, охлаждают, доводят до метки и взбалтывают.

Восстановитель - 0,2%-ный раствор аскорбиновой кислоты. 0,2 г растворяют в 100 мл воды.

Стандартный раствор KНРО. Этот раствор готовят из химически чистой соли, которую предварительно измельчают и высушивают на протяжении нескольких дней в эксикаторе. Взятую на аналитических весах в стаканчике навеску 2,1970 г соли растворяют дистиллированной водой и количественно переводят в мерную колбу вместимостью 500 мл. Для стойкости добавляют несколько капель хлороформа. При 20 °С раствор доводят до метки и перемешивают.