Методические указания по систематическому ходу анализа биологических сред на содержание пестицидов различной химической природы
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО СИСТЕМАТИЧЕСКОМУ ХОДУ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД НА СОДЕРЖАНИЕ ПЕСТИЦИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ*
_______________
* Методические указания разработаны Л.Г.Александровой (КНИИГТиПЗ); В.Ф.Демченко, Клисенко М.А. (ВНИИГИНТОКС).
Утверждено 08.06.87 N 4362-87
Методические указания направлены на определение микроколичеств пестицидов различного химического строения (фосфорорганические, хлорорганические; производные карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты; производные динитрофенолов, симм -триазина и др.) в биологических средах: кровь, моча, желчь, желудочный сок, слюна, грудное молоко.
Схема анализа биосред позволяет идентифицировать и определить количественно пестициды в одной пробе по методикам, утвержденным Минздравом СССР.
Методические указания могут быть использованы токсикологическими лабораториями санитарно-эпидемиологических станций, профпатологической службой, НИИ при изучении состояния здоровья сельскохозяйственных рабочих, контактирующих с пестицидами, населения, а также в случаях острой и хронической интоксикации пестицидами.
Принцип метода.
В основе систематического определения пестицидов в биологическом материале лежит извлечение пестицидов из биологической пробы диэтиловым эфиром, разделение эфирного экстракта на 3 части, в одной из которых определяют фосфорорганические пестициды, в другой - хлорорганические, в третьей - производные карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты и динитрофенолы (рис.17). Из биологической пробы после экстракции диэтиловым эфиром извлекают производное симм -триазина смесью гексан - ацетон, в оставшейся биопробе после извлечения метазина определяют зоокумарин. Для аналитического определения используют методы ГЖХ, ТСХ, ТСХЭ и спектрофотометрический.
Рис.17. Систематический ход определения пестицидов в биологических средах
Ход анализа.
Экстракция. Пробу биологической жидкости (5 мл крови, слюны, желчи, желудочного сока; 25-50 мл мочи, грудного молока) смешивают с 1 мл 1%-ного раствора хлорида натрия. К полученному раствору приливают диэтиловый эфир (кровь, слюна, желудочный сок, желчь - по 5 мл, моча и грудное молоко - по 10 мл) и экстрагируют в делительной воронке, осторожно встряхивая 30-40 мин. Экстракт сливают в мерный цилиндр. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Измеряют объем объединенного эфирного экстракта и делят на 3 части, каждую из которых анализируют в соответствии со схемой.
К оставшейся биопробе после экстракции диэтиловым эфиром приливают смесь гексан - ацетон 10 мл и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Гексановый экстракт отделяют, экстракцию повторяют еще дважды. Объединенный гексановый раствор пропускают через безводный сульфат натрия (анализируют метазин).
К биологической пробе после экстракции смесью гексан - ацетон приливают 1 н. раствор серной кислоты и перемешивают. Экстрагируют зоокумарин хлороформом.
Определение хлорорганических пестицидов и полихлорированных дифенилов. Экстракт (
часть) упаривают досуха и к сухому остатку приливают 5 мл гексана. В гексановом растворе методом ТСХ можно определить хлорорганические пестициды ДДТ, ДДД, ДДЭ [1] и полихлорпинен, полихлоркамфен в присутствии ДДТ и его продуктов превращения [2, 3].
Если определению ХОП мешают коэкстрактивные вещества, экстракт очищают концентрированной серной кислотой. Таким способом определяют ХОП в крови [3, 4].
В случае, если анализируют хлорорганические пестициды в присутствии полихлорированных дифенилов (ПХД), после очистки экстракта концентрированной серной кислотой (контроль очистки осуществляют методами ТСХ и ГЖХ) проводят щелочной гидролиз, после которого в гексановом экстракте определяют ХОП и ПХД методами ГЖХ и ТСХ. Если в этом случае анализ исследуемых соединений затруднен, проводят последующее окисление хромовым ангидридом и после этого анализируют экстракт на наличие ПХД методами ГЖХ и ТСХ [4, 5].
Определение фосфорорганических пестицидов. Эфирный экстракт ( часть) осторожно упаривают досуха и к сухому остатку приливают 5 мл ацетона и анализируют хроматоферментным методом (ХЭМ). Для этого на одну из хроматографических пластинок наносят пробу объемом до 50 мкл и стандартные растворы метафоса и ДДВФ, на другую - пробу и стандартные растворы хлорофоса, на третью - пробу и стандартный раствор метафоса. Хроматографируют в подвижной фазе хлороформ 1-ю и 3-ю пластинку, в подвижной фазе гексан - ацетон (1:1) - 2-ю пластинку. Анализируют по методике без активации 1-ю пластинку (обнаружение диброма, ДДВФ, хлорофоса, циодрина, рицида, фенитрооксона, Р-О фталофоса). На 2-й пластинке после активации в парах аммиака можно обнаружить ДДВФ и хлорофос, на 3-й пластинке после активации бромом и УФ-светом обнаруживают афуган, абат, антио, валексон, байтекс, фталофос, цидеал, фенкаптон, фозалон, метафос, метилнитрофос, карбофос, цианокс, фосфамид, корал [6].
После идентификации ТСХЭ можно провести анализ этой же пробы (ацетоновый раствор) методами ТСХ и ГЖХ на содержание фозалона и мильбекса [7], сайфоса [8], базудина, фосфамида [9, 10]. При анализе биологической пробы на содержание трихлорметафоса-3 ацетоновый раствор упаривают досуха, к сухому остатку приливают 1 мл гексана и анализируют методом ГЖХ [11].
Определение производных карбаминовой, тиокарбаминовой кислоты, динитрофенолов. Исследуемый эфирный экстракт анализируют на газовом хроматографе в интервале температур oт 140 до 160 °С в режиме программирования на неподвижной фазе ДС-550 или в изотермическом режиме при 140 °С на фазе ХЕ-60, или 160 °С на фазе SE-30 для идентификации тиокарбаминовых пестицидов: вернама, ронита, сутана, тиллама, эптама и ялана. Если определению мешают коэкстрактивные вещества, то эфир осторожно, при комнатной температуре, упаривают досуха (тиокарбаминовые пестициды достаточно летучие вещества), приливают 1 мл гексана и далее анализируют гексановый раствор [12]. Ронит и триаллат можно определить методом ТСХ [13, 14].
Аликвотную часть исследуемого раствора наносят на хроматографическую пластинку и определяют производные N-фенилкарбаминовой кислоты - карбин, ИФК, хлор-ИФК [15], бетанал [16], севин [17], дикрезил в присутствии севина, мезурола и их метаболитов [18].
Аликвотную часть экстракта анализируют на содержание производных динитрофенолов - акрекса, каратана и продуктов превращения акрекса - диносеба методом ТСХ [19].
Характерные реакции: для обнаружения производных карбаминовой кислоты - азосочетание; тиокарбаминовой - N-хлорирование и взаимодействие с о -толидином или взаимодействие с бромфеноловым реагентом; для производных динитрофенолов - реакция с нингидрином.
Определение производного симм- триазина и зоокумарина. К биологической пробе после экстракции диэтиловым эфиром приливают смесь гексан - ацетон (1:1) и трижды экстрагируют производное симм -триазина порциями по 10 мл, оставляя смесь на 1 ч. Гексановый раствор отделяют, объединяют 3 порции и далее анализируют по методике метазина [20].
После отделения гексанового экстракта, содержащего метазин, к оставшейся пробе приливают 1 мл 1 н. раствора серной кислоты, содержимое перемешивают, приливают 75 мл хлороформа и далее по методике определяют зоокумарин методами ГЖХ, ТСХ или спектрофотометрическим [21].
Если известны пестициды, объем исследований сужается и используется та часть схемы, в которую они могут входить.
В основу разработки положены:
1. Определение ДДТ, ДДЭ, ДДД, альдрина, дильдрина, гептахлора, кельтана, метоксихлора, эфирсульфоната и других ядохимикатов в воде, продуктах питания, кормах и биологических средах хроматографией в тонком слое//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1977. С.9-15.
________________
* Поз.1, 2, 5-8, 13-21. Документ не приводится. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.
2. Определение альдрина, гексахлорана, гептахлора, ДДТ, ДДД, ДДЭ в воде, овощах, фруктах и биологическом материале газожидкостной хроматографией//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1977 С.17-20.
3. Определение полихлорпинена и полихлоркамфена в воздухе, воде, почве, картофеле и свекле, мясе, молоке, тканях внутренних органов животных, крови, моче тонкослойной хроматографией*//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1977. С.62-69.
________________
* Настоящий документ включен в состав "Сборника методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12.06.2008 N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию". Часть 9 ( М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009 год). - Примечание изготовителя базы данных.
4. Методические указания по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах. N 3151-84 от 27.11.84 (см. с.19-25).
________________
* Настоящий документ включен в состав "Сборника методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12.06.2008 N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию". Часть 13 (М.: ФЦГиЭ Роспотребнадзора, 2010 год). - Примечание изготовителя базы данных.
5. Методические указания по определению хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов при их совместном присутствии в объектах внешней среды и биоматериале//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1983. С.10-18.
6. Методические указания по определению фосфорорганических пестицидов в растительных продуктах и биологических субстратах энзимохроматографическим методом. - М.: Колос, 1983. С.122-127.
7. Методические указания по определению фозалона и мильбекса в биологическом материале методом газожидкостной хроматографии. - М.: Колос, 1983. С.105-106.
8. Определение сейфоса в воде, продуктах питания растительного происхождения, почве, биологическом материале и воздухе тонкослойной хроматографией//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1977. С.133-137.
9. Методические указания по определению диазинона в биологических средах тонкослойной и газожидкостной хроматографией. N 4324-87 от 08.06.87 (см. с.117-122).
10. Методические указания по определению фосфамида в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии. N 4323-87 от 08.06.87 (см. с.117-122).
11. Методические указания по определению трихлорметафоса-3 и его метаболитов в биоматериале методом газожидкостной хроматографии//Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. N 2647-82 от 28.12.82 (см. с.148-150).
12. Методические указания по определению гербицидов производных тиокарбаминовой кислоты (вернаам, ронит, сутан, тиллам, эптам, ялан) в воде, почве, растительном материале, биосубстратах и воздухе газохроматографическим методом. N 1877-78 от 05.06.78 (см. с.388-393).
13. Определение триаллата в крови, моче, тканях внутренних органов животных тонкослойной хроматографией/Методы определения микроколичеств пестицидов. - М.: Колос, 1977. С.296-297.
14. Определение карбина, ИФК и хлор-ИФК в растительном материале и воде хроматографией в тонком слое. - М.: Колос, 1977. С.233-235.
15. Методические указания по определению ронита в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии. N 4668-88 от 07.07.88 (см. с.383-388).
16. Методические указания по определению бетанала в биологических средах методом хроматографии в тонком слое//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1983. С.148-150.
17. Методические указания по определению севина в биологических субстратах и воде методом тонкослойной хроматографии. - М.: Колос, 1983. С.162-163.
18. Определение дикрезила в биологических средах тонкослойной хроматографией//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1977. С.197-199.
19. Определение каратана, акрекса в воздухе, воде, огурцах, яблоках, биологическом материале и диносеба в биологическом материале тонкослойной хроматографией. - М.: Колос, 1977. С.225-230.
20. Методические указания по определению метазина в воде, почве, овощах и биологическом материале методом хроматографии в тонком слое сорбента//Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Ч.XI. - М.: МСХ СССР, 1981. С.181-187.
21. Методические указания по определению зоокумарина в тканях и крови животных, в приманках и препарата (пенокумарин) хроматографическим и спектрофотометрическими методами//Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. - М.: Колос, 1983. С.227-231.