Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78* или аналогичный.

________________

* ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, являются авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

2. Ротационный испаритель ИР-1М по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор") с ловушкой или аналогичный испаритель.

3. Мельница лабораторная электрическая ЭМ-ЗА по ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41 или "Люминоскоп" ЛПК-1.

5. Жидкостной хроматограф с УФ-детектором с переменной длиной волны (для анализа зеараленона возможно также использование флуориметрического детектора) колонка и предколонка с силикагелем с размером частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр - 4,6 мм.

6. Микрошприцы МШ-10 на 10 мкл, микрошприцы на 10 или 25 мкл для ВЭЖХ.

7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками.

8. Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15x15 см или 20x20 см, производство ЧСФР.

9. Колбы плоскодонные конические, 250 мл, НШ 29, тип КнКШ 250-29/32, ГОСТ 10394-74*.

_______________

* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 10394-72. На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ГОСТ 25336-82, ГОСТ 23932-90, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

10. Колбы грушевидные на 100 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

11. Колбы грушевидные на 10-20 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

12. Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

13. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

14. Воронки делительные ВД2-250 по ГОСТ 8613-75*.

_______________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 25336-82. - Примечание изготовителя базы данных.

15. Колонка стеклянная хроматографическая 220x15 мм.

16. Распылитель стеклянный с грушей.

17. Стандартные растворы дезоксиниваленола в этилацетате с концентрацией 25 нг/мкл каждый, стандартный раствор зеараленона в бензоле с концентрацией 10 нг/мкл.

18. Ацетонитрил "ч." по ТУ 6-09-3534-74.

19. Ацетон "ч.д.а." по ГОСТ 2603-79.

20. Бензол "ч.д.а." по ГОСТ 5955-75.

21. Гексан "ч." по ТУ 6-09-3375-78 или гептан "ч.д.а." по ГОСТ 5.395-70*.

_______________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ 25828-83. - Примечание изготовителя базы данных.

22. Изопропиловый спирт (пропанол-2) "х.ч." по ТУ 6-09-1710-77.

23. Кислота уксусная "ч.д.а." по ГОСТ 61-75.

24. Кислота муравьиная "ч." по ГОСТ 5848-73.

25. Метанол "ч.д.а." по ГОСТ 6995-77.

26. Толуол "ч.д.а." по ГОСТ 5789-78.

27. Хлороформ для наркоза или по ГОСТ 3610-51*.

______________

* Вероятно ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 3160-51. Отменен с 01.08.75 без замены (ИУС N 7-75). - Примечание изготовителя данных.

28. Этанол по ТУ 6-09-1710-77.

29. Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) "ч.д.а." по ГОСТ 22300-76.

30. Эфир диэтиловый по ГОСТ 6265-52*.

______________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действуют ТУ 7506804-97-90, являющиеся авторской разработкой. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.

31. Эфир петролейный (т. кип. 40-70 °С) по ТУ 6-02-1244-83.

32. Алюминий оксид нейтральный для хроматорафии по Брокману, "Реанал" (Венгрия) N 01125 или алюминий оксид для хроматографии по ТУ 6-09-916-75.

33. Алюминий хлористый, 6-водный "ч.д.а." по ГОСТ 3759-75.

34. Натрий сернокислый, безводный "ч.д.а." по ГОСТ 4166-76.

35. Натрий кислый углекислый "ч.д.а." по ГОСТ 83-79.

36. Натрий хлористый "ос.ч." по ТУ 6-09-3658-74.

37. Прочный синий В-соль (диазоль синий С) или прочный фиолетовый В-соль для гистологии, "Хемапол", ЧСФР.

38. Уголь активированный Р.72.270.3.

2.1. Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г порошка активированного угля и сверху - слой 0,75 г оксида алюминия. Над слоем оксида алюминия помещают кусочек ваты. Осторожно помещают в колонку 25 мл экстракта, соответствующие 5 г исходного образца (при анализе кукурузы наливают 15 мл экстракта, соответствующие 3 г исходного образца). Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют 10 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Объединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 мл, бумажный фильтр промывают 5-10 мл изопропилового спирта в ту же колбу и фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5-7 мл. Добавляют около 20 мл изопропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 200 мкл этилацетата и плотно закрывают стеклянной пробкой - (раствор А).

2.2. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью одномерной ТСХ

На пластинке "Силуфол" проводят тонкую карандашную линию в 1,5-2 см от нижнего края пластинки. На эту линию на расстоянии 2 см друг от друга с помощью микрошприца наносят 2, 5, 10 и 20 мкл раствора А. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 2, 4, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг дезоксиниваленола). Пластинку помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан-ацетон (3:2) на расстояние 15 см. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 3-4 минуты и опрыскивают 10%-ным раствором хлористого алюминия в этаноле. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5-7 минут при 105 °С, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией с Rf 0,25-0,30. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту дезоксиниваленола, свидетельствует о возможном наличии этого токсина в образце.

Для количественного определения сравнивает интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов дезоксиниваленола с интенсивностью - флуоресценции их пятен в образце, визуально оценивая количество нг токсинов в нанесенных на пластинку объемах раствора А. Концентрацию дезоксиниваленола в образце рассчитывают по формуле:

мг/кг,

где - объем раствора А в мкл (200 мкл);

- объем раствора А, нанесенный на пластинку в мкл;

- масса дезоксиниваленола (в нг) в , мкл, раствора А, оцененная визуальным сравнением со стандартом на ТСХ-пластинке;

- аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5 г для пшеницы, 3 г для кукурузы).

Если интенсивность флуоресценции пятна дезоксиниваленола в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола, соответствующего 6 мкл стандартного раствора, то следует разбавить раствор А этилацетатом, т.е. увеличить объем , внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

Окончательное заключение о наличии и уровне загрязнения образца дезоксиниваленолом принимается только на основе данных двумерной ТСХ.

2.3. Подтверждение наличия и количественное определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис.1. В правом нижнем углу на расстоянии 12 мм от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. В левом нижнем углу пластинки наносят 2, 4 и 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола, 2 и 5 мкл раствора А. В верхнем правом углу пластинки наносят 2, 4 и 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола, 10 и 20 мкл раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан-ацетон (3:2) и элюируют ее в первом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 4 см от верхнего края, пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во 2-ом направлении смесью эфир-гексан-изопропиловый спирт-вода (77:18:4,5:0,5). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 4,5 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Обнаружение и количественное определение проводят аналогично п.2.2.

2.4. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью вэжх

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан-изопропанол-вода (85:25:1,5), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливается на длину волны 224 нм, шкала чувствительности 0,005 Е.О.П. Входное напряжение самописца 10 мВ.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят по 2 и 4 мкл стандартных растворов, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных выше условиях ВЭЖХ время удерживания пика дезоксиниваленола составляет от 5 до 6 мин в зависимости от изменений в составе подвижной фазы.

В инжектор хроматографа вводят 10 мкл раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с каким-либо стандартом, определяют его высоту (). Расчет концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по формуле:

мг/кг,

где - объем раствора А, мкл (200 мкл);

- объем раствора А, внесенный в хроматограф, в мкл (10 мкл);

- масса стандарта дезоксиниваленола, введенная в хроматограф, в нг;

- аликвотная навеска образца, соответствующая раствору А (5 г для пшеницы, 3 г для кукурузы);

- высота пика, соответствующая данной массе стандарта, в мм;

- высота пика дезоксиниваленола из образца в мм.

Если пик дезоксиниваленола в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора А этилацетатом, т.е. после увеличения объема .

3.1. Очистка экстракта

В делительную воронку на 500 мл помещают 50 мл фильтрата, добавляют 50 мл гексана (или гептана), насыщенного ацетонитрилом (гексан, насыщенный ацетонитрилом, готовят следующим образом: в делительную воронку на 500 мл помещают 200 мл гексана и 30 мл ацетонитрила, интенсивно встряхивают и после расслоения жидкостей отделяют верхний слой, содержащий гексан). Встряхивают, после разделения слоев отбрасывают верхний гексановый слой. Нижний ацетонитрильный слой дважды встряхивают с 30 мл гексана, насыщенного ацетонитрилом, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. К обезжиренному ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 100 мл дистиллированной воды и 50 мл бензола. Встряхивают и после разделения слоев отделяют верхний бензольный слой. Если полного расслоения жидкостей не происходит, добавляют 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и смесь еще раз слегка встряхивают. Водный слой экстрагируют еще дважды 30 мл бензола, бензольные слои объединяют и сушат безводным сульфатом натрия. После фильтрования упаривают в грушевидной колбе на 100 мл на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45 °С. Сульфат натрия промывают 10 мл бензола в ту же грушевидную колбу и упаривают раствор досуха. Остаток растворяют в 500 мкл бензола - раствор В.

3.2. Обнаружение и идентификация зеараленона с помощью одномерной ТСХ

На пластинке "Силуфол" проводят тонкую карандашную линию на расстоянии 12 мм от нижнего края пластинки. На эту линию на расстоянии 2 см друг от друга наносят с помощью микрошприца 5 и 10 мкл раствора В. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 5, 10 и 20 мкл стандартного раствора зеараленона (50, 100 и 200 нг зеараленона соответственно). Аналогично готовят вторую пластинку "Силуфол". Обе пластинки помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан-ацетон (7:3). Пластинки извлекают, сушат на воздухе 3-4 мин.

Для обнаружения пятен зеараленона на 1-ой пластинке используют опрыскивание 10%-ным раствором хлорида алюминия в этиловом спирте с последующим нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С в течение 10 минут. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по цвету флуоресценции (синий) и хроматографической подвижности пятнам стандартов зеараленона, свидетельствует о возможном наличии зеараленона в образце.

Для подтверждения наличия зеараленона 2-ую ТСХ-пластинку опрыскивают 1%-ным раствором прочной синей В-соли или прочной фиолетовой В-соли в дистиллированной воде, затем пластинку немедленно опрыскивают 5%-ным раствором углекислого натрия до появления красно-бордовой окраски пятен стандарта зеараленона. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету и хроматографической подвижности стандартам зеараленона, подтверждает наличие зеараленона в образце.

3.3. Количественное определение зеараленона с помощью двумерной ТСХ

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля, согласно рис.2. В правом нижнем углу на расстоянии 12 мм от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора В. В правом верхнем углу наносят 3 и 7 мкл стандартного раствора зеараленона, 10 и 20 мкл раствора В; в левом нижнем углу наносят 5 и 10 мкл раствора зеараленона, 2 и 5 мкл раствора В. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан-ацетон (7:3) и элюируют в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 4,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят хроматографию во 2-ом направлении в системе толуол-этилацетат-хлороформ-85% муравьиная кислота (45:25:25:5) до достижения карандашной линии, проведенной в 4,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекает из камеры, сушат и обнаруживают пятна по флуоресценции после обработки раствором хлорида алюминия как описано в п.3.2. Сравнивая интенсивность окраски разных количеств стандарта зеараленона с интенсивностью окраски пятна зеараленона в экстракте (раствор В), определяют количество нг зеараленона в экстракте.

3.4. Обнаружение и количественное определение зеараленона с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан-эфир-уксусная кислота (65:35:1; скорость подвижной фазы 1,5 мл/мин) или петролейный эфир ( 40-70 °С) - эфир-уксусная кислота (50:50:1; скорость подвижной фазы 2 мл/мин). Рекомендуется использовать перегнанный гексан или петролейный эфир и эфир, профильтрованный через слой оксида алюминия (5 см). УФ детектор устанавливается на длину волны 283 нм, шкала чувствительности 0,005 Е.О.П. Шкала самописца 10 мВ. Если используется флуориметрический детектор, то длина волны на линии возбуждения устанавливается около 283 нм, а на линии эмиссии - фильтр от 420 нм (или 440 нм в случае монохроматора на линии эмиссии).

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 2 и 5 мкл стандартного раствора, что соответствует 20 и 50 нг зеараленона. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматoграмме. При описанных условиях ВЭЖХ время выхода пика зеараленона составляет 5-7 мин.

В инжектор хроматографа вводят 10 мкл раствора В. При наличии пика, совпадавшего по времени выхода со стандартом, определяют его высоту ().

Расчет концентрации зеараленона в образце проводят по формуле:

мг/кг,

где - концентрация зеараленона в образце в мг/кг;

- объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции в мл (125 мл);

- объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для анализа, в мл (50 мл);

- объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор В) в мкл (500 мкл);

- объем очищенного экстракта (раствор В), внесенный в хроматограф, в мкл (20 мкл);

- навеска образца, взятая для анализа, в г (25 г);

- масса стандарта зеараленона, введенная в хроматограф, в нг;

- высота пика, соответствующая данной массе стандарта, в мм;

- высота пика зеараленона из образца в мм.

Если пик зеараленона в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления раствора В бензолом, т.е. после увеличения объема .

При ВЭЖХ зеараленона чувствительность УФ- и флуориметрического детекторов примерно одинаковы. Преимуществом флуориметрического детектора является его селективность (меньшее количество посторонних пиков на хроматограмме).

По вопросам практического внедрения метода обнаружения, идентификации и определения содержания дезоксиниваленола и зеараленона в зерне и зернопродуктах следует обращаться в ТОО "Продэкспертиза" (Москва, 109240, Устьинский проезд, 2/14, тел. 297-77-95).

Сборник методических документов,
необходимых для обеспечения
применения Федерального закона
от 12.06.08 N 88-ФЗ. Часть 14. -
М.: Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010