МУК 4.2.1018-01 Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды (с Изменением N 1)

1. РАЗРАБОТАНЫ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Недачин А.Е., Доскина Т.В., Дмитриева Р.А., Тишкова Н.Ю., Сидоренко С.Г.), Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана Минздрава России (Трухина Г.М., Мойсеенко Н.Н., Сарафанюк Е.В.), Аналитическим центром контроля качества воды "Роса" (Кашкарова Г.П.), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Кривопалова Н.С., Сорокина Р.С.), Центром госсанэпиднадзора в г.Москве (Салова Н.Я., Малышева З.Г., Кожевникова Н.А.), Центром госсанэпиднадзора в Московской области (Козлова А.Т.), Московским НИИ генетики (Бовыкина Н.М.), НИИ коммунального водоснабжения и очистки воды (Русанова Н.А.), Российской медицинской академией последипломного образования (Власова И.В.), Российским государственным медицинским университетом (Пивоваров Ю.П.).

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 9 февраля 2001 г.

3. С момента ввода данных методических указаний считаются утратившими силу методические указания МУК 4.2.671-97 "Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды" и Информационно-методическое письмо Департамента государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Российской Федерации N 1100/1670-98-111 "О дополнительных мерах по осуществлению контроля качества питьевой воды по микробиологическим и паразитологическим показателям".

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

ВНЕСЕНО Изменение N 1, утвержденное и введенное в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23 декабря 2010 года

Изменение N 1 внесено изготовителем базы данных по тексту М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 год

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы санитарно-микробиологического контроля качества питьевой воды в отношении ее эпидемической безопасности по показателям СанПиН 2.1.4.559-96 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".

1.2. Методические указания предназначены для лабораторий организаций, предприятий и иных хозяйственных субъектов, осуществляющих производственный контроль, а также органов санитарно-эпидемиологической службы, обеспечивающих государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения.

2.1. Санитарные правила и нормы. "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества". СанПиН 2.1.4.559-96.

2.2. Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". СП 1.2.731-99.

2.3. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.

3.1.1. Отбор проб производит специалист после прохождения инструктажа по технике выполнения отбора проб для микробиологического анализа.

3.1.2. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.

3.1.3. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.

3.1.4. При отборе проб в одной и той же точке для различных целей первыми отбирают пробы для бактериологических исследований. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного количества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до стерилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 10 мг на 500 мл воды.

3.1.5. Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запрещается.

3.1.6. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

3.1.7. Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации.

3.2.1. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре (4-10) °С. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.

Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.

Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.

Пробы питьевой воды должны доставляться в отдельных продезинфицированных контейнерах.

4.5.1. Контрольный колифаг МS2, штамм ВКПМ-3254 Е. coli К12 получают в ГНИИ Генетика - Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ - Россия, 113545, г.Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1).

4.5.2. Штамм Е. coli М17-02 и один из штаммов: Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens получают в Государственном Национальном Органе контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Минздрава России (Россия, 121002, г.Москва, ул.Сивцев-Вражек, д.41).

Примечание.

В производственных лабораториях, расположенных на территории водопроводных станций, следует использовать штамм Pseudomonas fluorescens.

5.2.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

5.2.2. Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.

5.3.1. Готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

5.3.2. Питательный агар для определения колифагов прямым методом готовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от прописи.

5.3.3. Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.

5.3.4. Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0-7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.

5.3.5. Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры (45-49) °С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.

5.4.1. Основная модификация

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2-3 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.

5.4.2. Повышение дифференцирующих свойств среды

Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60-70) °С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5%-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина - не более 1 мес.

5.4.3. Модификация среды с добавлением розоловой кислоты

В случае роста микрофлоры, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5%-го спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты - не более 1 месяца.

Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной фильтрации.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4-7,6, разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при (112±2) °С 12 мин.

Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

5.6.1. Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата

Готовят по способу, указанному на этикетке.

Срок хранения - не более 2 недель при комнатной температуре.

Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды "карманы" - потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

5.6.2. Полужидкая среда с лактозой

Готовят при отсутствии сухого препарата.

В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, (4-5) г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 1 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120±2) °С 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту (3-5) см и стерилизуют при (112±2) °С 12 мин. Срок хранения - не более 2 недель при комнатной температуре.

Правильно приготовленная среда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). При образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.

5.6.3. Лактозо-пептонная среда

Готовят по п.5.5 с добавлением 1 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего на 1 л и разливают по (3-5) мл в пробирки с поплавком.

5.6.4. СИБ-лактоза

Готовят по прописи завода-изготовителя.

5.7.1. Вариант 1

1%-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.

5.7.2. Вариант 2

Реактив N 1. 1%-ный спиртовой раствор -нафтола.

Реактив N 2. 1%-ный водный раствор фенилендиаминового соединения.

Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1 - до одного месяца, 2 - до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.

Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги).

Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens) и отрицательную оксидазную реакцию (E. coli).

5.9.1. Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.

5.9.2. Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.

5.9.3. Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.

8.1.1. Определение понятия показателя

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.

8.1.2. Выполнение анализа

Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл.

После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8-12) мл (на чашку диаметром 90-100 мм) расплавленного и остуженного до (45-49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру (45-49) °С.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

8.1.3. Учет результатов

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают "число КОЕ/мл - ориентировочно".

Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают "сплошной рост".

8.2.1. Определение понятия показателя

Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (37+1) °С в течение (24-48) ч.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре (44±0,5) °С в течение 24 ч.

8.2.2. Принцип метода

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через фильтрующие материалы, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

8.2.3. Выполнение анализа

8.2.4. Учет результатов

8.3.1. Определение понятия показателя

Определение понятия показателей ОКБ и ТКБ по п.8.2.1.

8.3.2. Область применения

Титрационный метод может быть использован:

- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

8.3.3. Принцип метода

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

8.3.4. Выполнение анализа

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п.5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (п.5.4.1) для получения изолированных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (18-20) ч.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

- если в среде накопления отмечено только помутнение;

- если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

В этих случаях:

- проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;

- выполняют оксидазный тест по п.8.2.3.2;

- подтверждают принадлежность к Граму по п.8.2.3.3;

- подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п.5.6 с последующей инкубацией посевов при температуре (37±1) °С в течение (24-48) ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами.

Отрицательный ответ дают, если:

- в среде накопления нет признаков роста;

- на секторах среды Эндо нет роста;

- на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т.п.);

- все колонии оказались оксидазоположительными;

- все колонии оказались грамположительными;

- если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п.5.6.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44±0,5) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через (4-6) ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п.5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44±0,5) °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

8.3.5. Учет результатов

При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе "обнаружены в 100 мл".

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по табл.1.1 приложения 1.

Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе "не обнаружены в 100 мл".

8.4.1. Определение понятия показателя

Сулъфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре (44±1) °С в течение (16-18) ч.

8.4.2. Принцип метода

Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.

8.4.3. Выполнение анализа

8.4.4. Учет результатов

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.

Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл воды.

При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ "не обнаружено в 20 мл воды".

При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают "обнаружено в 20 мл". При необходимости получения количественного результата анализ повторяют.

8.5.1. Определение понятия показателя

Колифаги - бактериальные вирусы, способные лизировать E. coli и формировать при температуре (37±1) °С через (18±2) ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

8.5.2. Титрационный метод определения колифагов

8.5.3. Прямой метод определения колифагов

8.5.4. Постановка контролей

1.1. Восстановление лиофилизированной эталонной культуры

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение (1-2) мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят 0,5 мл питательного бульона (п.5.2.1) для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при (37±1) °С в течение 18-24 ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар в две пробирки (п.5.3.1).

При восстановлении штамма E. coli К12 посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (п.5.3.5).

Посевы инкубируют при 37 °С в течение (18-24) ч.

Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным свойствам (п.п.1.5.2-1.5.5 приложения 2).

Второй посев на скошенном питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры (п.1.2 приложения 2).

Оставшуюся бульонную культуру E. coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано в пункте 1.5.1 приложения 2.

При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам и (или) при наличии более 25% полиморфных (нетипичных) колоний в R-форме полученную культуру для работы не используют.

1.2. Создание запасов рабочей культуры

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов (п.п.1.5.1-1.5.5 приложения 2) культуру со скошенного питательного агара (для E. coli К12 - с питательного агара со стрептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром (п.5.3.4). В зависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4-10 пробирок, из расчета по 1-3 пробирки на 1 мес. работы и 1 пробирки для восполнения запасов рабочей культуры через 3 мес. на следующий квартал (п.1.3 приложения 2).

Посевы инкубируют (18-24) ч при 37 °С. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми) пробками и закладывают на хранение при температуре (4-8) °С.

Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

1.3. Восполнение запасов рабочей культуры

Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3 мес.).

Для восполнения запасов рабочей культуры используется субкультура на среде хранения, полученная ранее при создании запасов или при очередном их восполнении.

Из пробирки с культурой, предназначенной для восполнения запасов, производят посев в питательный бульон. Посевы инкубируют при 37 °С (18-24) ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей в две пробирки со скошенным питательным агаром (п.5.3.1). При ведении штамма E. coli К12 посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (5.3.5). Посевы инкубируют при 37 °С (18±2) ч.

Один из посевов используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным свойствам (п.п.1.5.2-1.5.5 приложения 2).

Второй посев на скошенном питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры (п.1.2 приложения 2).

Оставшуюся бульонную культуру E. coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано в п.1.5.1 приложения 2.

При наличии более 25% полиморфных (нетипичных) колоний и (или) при несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам полученную культуру для дальнейшей работы не используют.

Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранение осуществляется согласно п.1.2 приложения 2.

Восполнение запасов рабочей культуры проводят только три раза.

По истечении года использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.

1.4. Подготовка культуры для целевого использования в анализе

Накануне использования культуру с полужидкого агара высевают на 2 пробирки со скошенным питательным агаром (п.5.3.1). Для культуры E. coli К12 используют питательный агар со стрептомицином (п.5.3.5). Посев инкубируют (18-24) ч при 37 °С.

Культуру из одной пробирки используют по назначению. Вторая пробирка с культурой на скошенном питательном агаре используется для получения культуры для работы на следующий (второй) день.

При необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.

1.5. Контроль эталонных бактериальных культур

Постановка контроля включает:

• оценку степени диссоциации культуры E. coli М17-02;

• проверку видовых свойств бактериальных культур;

• проверку способности E. coli К12 проверку культуры E. coli К12 на однородность и отсутствие загрязнения фагом.

2.1. Восстановление лиофилизированной культуры

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.

Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение (1-2 мин). Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят 0,5 мл питательного бульона для регидратации.

2.2. Создание запасов эталонных культур фага и культур для целевого использования

Рабочую культуру E. coli К12 , хранящуюся на полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при (37±1) °С (18-24) ч.

После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно засевают в 3-4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при (37±1) °С. Через 2 час инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага  *, инкубацию продолжают до (18-24) ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.

_________________

* Текст соответствует оригиналу.

Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.

Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле чувствительности культуры E. coli К12 к фагу. Две других служат запасом эталонного фага.

Активность полученной культуры определяется титром фага. Для использования допускается культура с титром более 10 -10. Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра хранящегося фага.

2.3. Определение титра фага

Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведений культуры фага (п.2.2). По 1 мл каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного агара и E. coli К12 , приготовленной аналогично описанному в п.1.5.4 приложения 2. Посевы инкубируют при (37±1) °С. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре (4±2) °С для приготовления рабочих суспензий фага.

Через (18-24) ч инкубации просчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30-100 негативных колоний фага.

При получении титра менее 10 фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживание ультрафиолетовым облучением.