Качественное и количественное определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания и пищевом сырье с использованием "сухих" наборов реагентов серии "RT-ПЦР - ядро"

5.1.1. Зона регистрации и предобработки образцов предназначена для регистрации поступающего в лабораторию материала, его временного хранения и подготовки анализируемых образцов для выделения ДНК.

5.1.2. Зона выделения ДНК предназначена для выделения ДНК из исследуемого материала, прошедшего предобработку в предыдущей зоне, а также временного хранения проб выделенной ДНК.

5.1.3. Зона проведения ПЦР предназначена для приготовления реакционной смеси (внесение растворителя и олигонуклеотидов в готовую "сухую" амплификационную смесь), проведения ПЦР-анализа и детекции результатов в режиме реального времени.

5.3.1. Весь материал, поступающий в ПЦР-лабораторию для исследования, должен быть промаркирован и обязательно зарегистрирован в специальном журнале постоянным сотрудником, который несет персональную ответственность за сохранность исследуемого материала в течение требуемого срока, а также утилизацию этого материала.

5.3.2. Необходимо использовать одноразовые пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК и приготовления реакционной смеси.

5.3.3. Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обработать реагентами, вызывающими разрушение ДНК.

5.3.4. Необходимо строго соблюдать условия хранения всех используемых реагентов, указанные в прилагаемой к набору инструкции. Образцы ДНК и анализируемый материал должны храниться отдельно от реагентов. Запрещается использовать реагенты с просроченным сроком годности или хранившиеся в ненадлежащих условиях.

5.3.5. Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте. Во всех помещениях ПЦР-лаборатории должна регулярно проводиться ежедневная влажная уборка. Рабочие поверхности столов перед началом и по окончании работ должны быть обработаны соответствующими реагентами или ультрафиолетовым излучением для деградации ДНК.

5.4.1. Персонал, работающий в ПЦР-лаборатории, где используется метод ПЦР в режиме реального времени, должен пройти соответствующее обучение.

6.1.1. Программируемый термостат (амплификатор) с детекцией ПЦР-продукта в реальном времени; Smart-CyclerII (Cepheid, USA) с принадлежностями. Характеристики приведены в Таблице 1.

6.1.2. Микроцентрифуга-вортекс ТЭТА-2 (скорость вращения 250-3000 об./мин).

6.1.3. Центрифуга настольная для микропробирок (скорость вращения 10000 об./мин/5000 ).

6.1.4. Термостат "ТЕРМО 24-15" для микропробирок объемом 0,5 мл/1,5 мл.

6.1.5. Охладитель проб для микропробирок объемом 0,5 мл/1,5 мл.

6.1.6. Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678.

6.1.7. Система получения деионизованной воды.

6.1.8. Облучатель бактерицидный.

6.1.9. Микродозаторы одноканальные переменного объема:

20-200 мкл с шагом 1,0 мкл, с точностью ±3,0 ±0,6%;

6.1.10. Штативы "рабочее место" для микропробирок объемом 1,5 мл/0,5 мл/0,2 мл.

6.1.11. Штативы-контейнеры для хранения образцов в микропробирках объемом 1,5 мл.

6.1.12. Контейнер для сброса наконечников.

6.1.13. Пробирки полипропиленовые конические объемом 1,5 мл.

6.1.14. Пробирки полипропиленовые для Smart-Cycler с герметичными крышками, объемом 25 мкл.

6.1.15. Наконечники для микродозаторов в штативе.

6.1.16. Перчатки резиновые или латексные неопудренные.

6.1.17. Пинцеты медицинские ГОСТ 21241-89.

6.1.18. Скальпели хирургические.

6.1.19. Ступки фарфоровые с пестиками.

6.1.20. Цилиндр стеклянный мерный лабораторный на 100 мл ГОСТ 1770-74.

6.1.21. Пестики-гомогенизаторы для конических пробирок объемом 1,5 мл.

Допускается использование аналогичного оборудования с характеристиками не хуже указанных.

Таблица 1

     
Характеристика программируемого термостата (амплификатора)
с детекцией ПЦР-продукта в реальном времени Smart-CycIer II (Cepheid, USA)

6.2. Реагенты

7.1.1. Содержимое каждой из десяти упаковок анализируемого материала, принадлежащих к одной партии, тщательно перемешивают при помощи одноразового шпателя.

7.1.2. Отбирают от каждой упаковки по 1000 мкл содержимого.

7.1.3. Переносят каждую аликвоту в одноразовую пластиковую пробирку объемом 15 мл и тщательно перемешивают, формируя таким образом объединенную пробу (10 мл).

7.1.4. Из этой пробы отбирают при помощи автоматического дозатора среднюю пробу в 1 мл, которую помещают в одноразовую микропробирку объемом 1,5 мл, опечатывают и отправляют на анализ.

7.1.5. В качестве лабораторной пробы для проведения выделения ДНК используют 100-150 мкл, отобранные из средней пробы в одноразовую микропробирку объемом 1,5 мл при помощи микродозатора.

7.2.1. Из исследуемой партии отбирают не менее 10 навесок по 5-10 г каждая, которые помещают в одноразовый полиэтиленовый пакет размером 20х30 см и перемешивают при помощи одноразового шпателя, формируя объединенную пробу (50-100 г).

7.2.2. Из этой пробы отбирают среднюю пробу в 10 г, которую помещают в герметично закрывающийся контейнер, опечатывают и отправляют на анализ. Если средняя проба не является гомогенной или мелкоизмельченной, то перед началом проведения анализа ее необходимо поместить в фарфоровую ступку и растереть фарфоровым пестиком до однородного мелкодисперсного гомогенного состояния.

7.2.3. В качестве лабораторной пробы для проведения выделения ДНК используют 75-100 мкл по насыпному объему, отобранные из средней пробы в одноразовую микропробирку объемом 1,5 мл при помощи одноразового шпателя.

7.3.1. Из исследуемой партии отбирают не менее 10 навесок по 5-10 г каждая, которые помещают в одноразовый полиэтиленовый пакет размером 20х30 см и перемешивают при помощи одноразового шпателя, формируя объединенную пробу (50-100 г).

7.3.2. Из объединенной пробы отбирают среднюю пробу весом 10 г, которую помещают в герметично закрывающийся контейнер, опечатывают и отправляют на анализ.

7.3.3. Перед началом проведения анализа среднюю пробу измельчают при помощи скальпеля (ножниц), помещают в фарфоровую ступку и растирают фарфоровым пестиком до однородного мелкодисперсного гомогенного состояния.

7.3.4. В качестве лабораторной пробы для проведения выделения ДНК используют 100-150 мкл по насыпному объему, отобранные из гомогенной средней пробы в одноразовую микропробирку объемом 1,5 мл при помощи одноразового шпателя.

7.4.1. Образцы исследуемого материала хранят в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа) согласно условиям, указанным производителем.

7.4.2. Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для их хранения. Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности исследуемого материала.

8.1.1. Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок, включая отрицательный контроль выделения ДНК. В пробирки, предназначенные для исследуемых проб, внести образцы исследуемых проб (см. раздел 7).

8.1.2. Содержимое флаконов из набора для выделения с концентратами буферов ОБ 1 и ОБ 2 доводят до 50 мл 95-96%-м этиловым спиртом (ректификат) в мерном цилиндре, переливают назад во флакон и перемешивают путем переворачивания плотно закрытых флаконов 5-6 раз. Хранят рабочие растворы ОБ 1 и ОБ 2 в плотно закрытых флаконах при температуре 4 °С.

8.1.3. В каждую пробирку с исследуемой пробой вносят 400 мкл лизирующего буфера ЛБ и гомогенизируют с помощью микрогомогенизатора (в случае кристаллизации буфера ЛБ перед употреблением его необходимо подогреть в термостате при 50-60 °С и перемешать до полного растворения осадка).

8.1.4. Пробу инкубируют в термостате 30 мин при 65 °С. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортексе. В случае, когда содержимое пробирки затвердело во время инкубации в термостате, в эту же пробирку добавляют 300 мкл (при необходимости до 1000 мкл) буфера ЛБ и тщательно перемешивают на микроцентрифуге-вортексе. Затем пробу центрифугируют 10 мин при 10000 об./мин (5000-6000 ). Надосадочную жидкость, не задевая осадка, полностью отбирают с помощью микродозатора и переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл.

8.1.5. К надосадочной жидкости добавляют 40 мкл суспензии сорбента. Перед использованием сорбент перемешивают на микроцентрифуге-вортексе до получения однородной суспензии. Далее содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортексе и инкубируют при комнатной температуре 7-10 мин, периодически перемешивая путем переворачивания плотно закрытой пробирки 2-3 раза. Затем содержимое осаждают на микроцентрифуге-вортексе 60 с при максимальных оборотах. Надосадочную жидкость полностью удаляют при помощи автоматического микродозатора.

8.1.6. К осадку добавляют 500 мкл рабочего раствора буфера ОБ 1, содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортексе до получения однородной суспензии, а затем центрифугируют на микроцентрифуге-вортексе 20 с при максимальных оборотах. Надосадочную жидкость удаляют микродозатором или декантированием.

8.1.7. К осадку добавляют 500 мкл рабочего раствора ОБ 2, содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге-вортексе до получения однородной суспензии, а затем центрифугируют на микроцентрифуге-вортексе 20 с при максимальных оборотах. Надосадочную жидкость удаляют микродозатором или декантированием.

8.1.8. Повторяют операции, изложенные в п.8.1.7. В последний раз надосадочную жидкость удаляют как можно более полно, не задевая при этом осадка.

8.1.9. Пробирку открывают и сушат осадок в термостате 5-7 мин при 65 °С.

8.1.10. К высушенному осадку добавляют 75 мкл буфера ТЕ. Перемешивают содержимое пробирки на микроцентрифуге-вортексе до получения однородной суспензии и термостатируют 10 мин при 65 °С. (Если осадок сорбента сразу не суспендируется, пробирку помещают в термостат на 2-3 мин, после чего вновь перемешивают).

8.1.11. Содержимое пробирки еще раз перемешивают на микроцентрифуге-вортексе и центрифугируют в течение 2 мин при 10000 об./мин (5000 ).

8.1.12. Надосадочную жидкость (экстракт ДНК) переносят в новую пробирку, не задевая при этом осадка, поскольку попадание в нее сорбента может в дальнейшем приводить к ингибированию ПЦР.

8.1.13. Полученный экстракт ДНК хранить при 4 °С не более 1 мес или при минус 18 °С не более 1 года.

8.2.1. Размещают в штативе и маркируют необходимое количество пробирок "ПЦР-ядро" по числу анализируемых проб, включая пробирки для положительного и отрицательного контролей. Для повышения достоверности результатов анализа рекомендуется его проведение в трех повторностях для каждого образца.

8.2.2. В каждую пробирку "ПЦР-ядро" добавляют по 10 мкл ПЦР растворителя и по 5 мкл соответствующей проводимому анализу смеси праймеров (если смесь праймеров хранилась в замороженном состоянии, ее необходимо разморозить в охладителе проб при 4 °С, и, используя микроцентрифугу-вортекс, перемешать 5-10 с, а затем осадить капли на дно пробирки; при работе с праймерами их необходимо держать при 4 °С в охладителе проб).

8.2.3. В пробирки "ПЦР-ядро" с ПЦР смесью добавляют анализируемые и контрольные образцы:

1. а. в пробирки "ПЦР-ядро" для исследуемых образцов вносят по 10 мкл соответствующего препарата ДНК;

b. в одну из пробирок "ПЦР-ядро" для отрицательного контроля (К-) вносят 10 мкл буфера ТЕ из комплекта используемого набора для выделения ДНК (Silica );

с. в последнюю очередь (!!!) еще в одну пробирку "ПЦР-ядро " для положительного контроля (К+) вносят 10 мкл раствора положительного контроля .

8.2.4. Содержимое еще раз аккуратно перемешивают в пробирках путем встряхивания на микроцентрифуге-вортексе. После растворения и перемешивания содержимое пробирок "ПЦР-ядро" полностью переносят в специальные пробирки для Smart-Cycler объемом 25 мл и плотно закрывают крышки.

8.2.5. Центрифугируют пробирки 3-5 с на центрифуге из комплекта принадлежностей для Smart-Cycler.

8.2.6. Пробирки с готовой ПЦР смесью помещают в амплификатор Smart-Cycler и запускают программу амплификации (табл.2).

Таблица 2

8.3.1. Размещают в штативе и маркируют соответствующим образом необходимое количество пробирок "ПЦР-ядро" (из расчета две пробирки - на анализ одного образца), для повышения достоверности результатов анализа рекомендуется его проведение в трех повторностях для каждого образца.

8.3.2. Для построения калибровочной кривой используют калибровочные растворы ГМ сои линии 40-3-2 с содержанием ГМ ДНК 0,1, 1,0, 5,0% (положительные контроли). Для этого в штативе дополнительно размещают и маркируют 3 пары пробирок "ПЦР-ядро".

8.3.3. В каждую пробирку "ПЦР-ядро" добавляют 10 мкл ПЦР растворителя.

8.3.4. В одну из пробирок от каждой пары вносят по 10 мкл смеси праймеров, специфичных для гена-вставки ср4 и зонда, меченого FAM.

8.3.5. Во вторую пробирку от каждой пары вносят по 10 мкл смеси праймеров, специфичных для гена лектина сои leс и зонда, меченого ROX.

8.3.6. В каждую пару пробирок "ПЦР-ядро" с готовой ПЦР смесью добавляют по 5 мкл препарата ДНК каждого из исследуемых образцов. Для построения калибровочных кривых вместо образцов ДНК в каждую пару дополнительных пробирок вносят по 5 мкл калибровочного раствора ДНК (0,1, 1,0, 5,0%).

8.3.7. Содержимое всех пробирок перемешивают на микроцентрифуге-вортексе.

8.3.8. Осаждение ПЦР смеси проводят в течение 5-7 с на микроцентрифуге-вортексе при максимальных оборотах.

8.3.9. После растворения и перемешивания содержимое пробирок полностью переносят в специальные пробирки для Smart-Cycler объемом 25 мкл и плотно закрывают крышки.

8.3.10. Осаждение смеси проводят в течение 3-5 с на центрифуге из комплекта принадлежностей для Smart-Cycler.

8.3.11. Пробирки с готовой ПЦР смесью помещают в амплификатор Smart-Cycler и запускают программу амплификации (табл.3).

Таблица 3

9.1.1. Детекцию продукта ПЦР проводят в соответствии с описанием к амплификатору Smart-Cycler. Амплификатор в процессе работы регистрирует величины флуоресценции по каналу для красителя FAM и с помощью программного обеспечения строит кривые. В положительном контроле должно наблюдаться увеличение интенсивности флуоресценции, а построенный прибором график в этом случае должен иметь вид S-образной кривой (см. рис.1), что свидетельствует о нормальном протекании ПЦР. Подобная картина должна наблюдаться и во всех положительных образцах. В отрицательном контроле не должно происходить накопления продукта ПЦР, поэтому построенный прибором график в этом случае должен иметь вид прямой линии, что подтверждает корректность проводимого анализа. Подобная картина должна наблюдаться и во всех отрицательных образцах.

9.1.2. Результаты качественного анализа отображаются в сводных таблицах (колонка для FAM) и обозначаются POS (positive) для положительных образцов и NEG (negative) для отрицательных образцов.

9.2.1. Учет первичных результатов ПЦР в реальном времени проводят путем определения точки начала log-фазы по красителям FAM () и ROX (), которые выражены в количестве выполненных циклов амплификации (данные выводятся в сводную таблицу результатов в соответствующем окне компьютерной программы - см. инструкцию к прибору Smart-Cycler).

9.2.2. Данные по процентному содержанию ГМИ, и для трех калибровочных растворов в трех повторностях вводят в таблицу в формате "Excel" (см. диск-приложение к набору реагентов).

Дальнейший расчет параметров линейного приближения (калибровочная кривая) производится программно по методу наименьших квадратов (Лакин Г.Ф., Биометрия. М.: Высшая школа. 1990, С.255-259).

9.2.3. В таблицу вносят значения и для анализируемых образцов, при этом расчет процентного содержания ГМИ производится автоматически.

9.2.4. Полученные для образцов значения процентного содержания ГМИ считаются достоверными, если коэффициент корреляции составляет не менее 0,95. В противном случае постановку с калибровочными растворами нужно повторить.