МР 01.018-07 Методика определения токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм"
МР 01.018-07
Методика определения токсичности химических веществ,
полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм"
РАЗРАБОТАНЫ: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Севостьянова Е.М.), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (Данилов B.C.), ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В., Ластенко Л.С., Федосеева).
С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации "Определение интегральной токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста" от 8 июня 2000 г. МР N 11-131-09
УТВЕРЖДЕНЫ: Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Председателем Лабораторного совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И. Верещагиным 15 июня 2007 г.
1. Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает методику определения токсичности отдельных химических соединений, токсичности и соответствие качества различных материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции, материалы, применяемые в водоснабжении и в качестве материалов, контактирующих с пищевыми продуктами. Тест-система представлена биосенсорами серии "Эколюм" и измерительным прибором серии "Биотокс-10".
Документ предназначен для учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации и специальных служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Результаты исследования качества материалов и изделий учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного отрицательного влияния на здоровье человека и прогнозе степени их опасности для населения.
2.*Нормативные ссылки
1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.
2. СанПиН 42-123-4240-86* "Допустимые количества миграции химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми средами и методы их определения"
______________
* На территории Российской Федерации действуют ГН 2.3.3.972-00, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
1.* Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.
2.* СанПиН 42-123-4240-86 "Допустимые количества миграции химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми средами и методы их определения"
4. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
5. ГН 2.3.3.972-00 "Предельно допустимые количества химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми продуктами". _______________
* Вероятно ошибка оригинала. Пункты приводятся повторно. - Примечание изготовителя базы данных.
3. Термины и определения
Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением гигиенических нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в объекты окружающей среды.
Химическое загрязнение объектов окружающей среды - изменение химического состава объектов окружающей среды (в том числе материалов и изделий), возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение их качества и возможную опасность для здоровья населения.
Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество материалов и изделий, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности материалов и изделий при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.
Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности образца. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты , регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
4. Принцип методики
В качестве тест-объекта используются препараты лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.
Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в анализируемой пробе воды по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
5. Количественная оценка параметров тест-реакции
Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции за 30 минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.
Индекс токсичности "
", равный отношению 
, где 
и 
соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с биотестом.
Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения и , позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слаботоксического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильнотоксический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).
ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечение биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (
) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой 
, где и соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец сильно токсичен. График -функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет представлять величины для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.
Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:
- допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20; объем пробы или концентрация вещества в пробе меньше величины ЕС20;
- образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) меньше величины ЕС50 и больше или равен ЕС20;
-высокая токсичность образца: индекс токсичности равен или более 50; объем пробы (или концентрация вещества в пробе) равен или больше величины ЕС50.
6. Оборудование, материалы, реактивы
1 Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.
2. Прибор серии "Биотокс-10", сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31.003.A N 21703, с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл;
3. Весы лабораторные общего назначения, ГОСТ 24104;
4. pH-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;
5. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы - 0,5 °С, ГОСТ 215;
6. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;
7. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (+2
+4 °С);
8. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;
9. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которой можно разместить не менее 12 кювет;
10. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;
11. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02 - 0,5 мл±1,0%;
12.Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;
13.Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;
14. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;
15. Пробоотборник любого типа, объемом не менее 5 мл;
16. Флаконы и банки, стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;
17. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;
18. Стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148;
19. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;
20. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328;
21. Кислота соляная, ГОСТ 3118;
22. Кислота серная, ГОСТ 4204;
23. Спирт этиловый, х.ч., ТУ 6-091710;
24. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174;
25. Бумага индикаторная универсальная для измерения pH.
7. Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"
Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01. Биосенсор находится в стеклянных флаконах в среде инертных газов. При температуре 2-4 °С и ниже имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.
Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием биолюминесцентных биосенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.
Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, и усредненной величины индекса токсичности;
вычисление стандартного отклонения показателя токсичности. Прибор проводит определение величин EC20 и ЕС50 - пороговых значений допустимой степени и степени токсичноcти образца; исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерную обработку данных измерения.
8. Условия безопасного проведения работ
8.1. При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
8.2. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
8.3. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
8.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
8.5. Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.
8.6. Хранить биосенсор "Эколюм" в холодильнике при температуре от -18 °С до 2-4 °С, следует беречь биоcенсор от нагревания и резкой смены температуры.
9. Требования к квалификации лиц, проводящих биотестирование
Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант.
10. Условия выполнения измерений
Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.
Температура окружающего воздуха в лаборатории от +15 до 30 °С. Относительная влажность воздуха 80±5%. Атмосферное давление 84-106 кПа (630-800 мм рт.ст.).
При использовании электроприборов частота переменного тока 50±1 Гц. Напряжение сети 220±10 В.
Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.
11. Подготовка к проведению измерений
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание каких-либо химических веществ в исследуемую пробу.
11.1. Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования
Обычно используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2-3 час посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3-4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться закрытой стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.
11.2 Отбор, транспортировка, хранение и подготовка проб
При приготовлении пробы составляется протокол по утвержденной форме, в котором указывается цель пробоотбора, число, время, номер пробы, Ф.И.О сотрудника. На стакан или флакон наклеивается этикетка с указанием характера пробы, места и даты приготовления пробы.
11.2.1 Извлечение водорастворимых форм химических соединений из материалов и изделий. В сосуд помещают изделие или его часть и заливают 5-ти кратным объемом (5 мл на 1 г образца) дистиллированной воды (pH 7.0-7.4) и выдерживают в течение 24 часов. Полученный экстракт тестируют на токсичность. В определения качества изделия по сравнению с эталонным образцом завода-производителя последний заливают 5-ти кратым объемом (5 мл на 1 г образца) дистиллированной воды (pH 7.0-7.4) и водную вытяжку используют как контрольный раствор.
Возможно использование водно-органических растворов для экстракции химических веществ из исследуемого образца. В таком случае этот раствор должен быть использован в качестве контроля при измерении с использованием биосенсора.
11.2.2. Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.
11.3. Подготовка тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"
11.3.1. Подготовку прибора "Биотокс-10" проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
11.3.2. Реконструкция тест-системы "Эколюм".
11.3.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным биосенсором. Добавить 10 мл дистиллированной воды (комнатная температура, pH 6.8-7.4) - получают исходную суспензию биопрепарата. В случае необходимости pH дистиллированной воды доводят до нужного диапазона подщелачиванием раствором NaOH или подкислением раствором HCl. При отсутствии такой воды или её плохого качества можно использовать стандартный физиологический раствор.
11.3.2.2. Выдержать суспензию биопрепарата в течение 30 минут, периодически перемешивая.
11.3.2.3. Держать флакон с суспензий можно на лабораторном столе при нормальном освещении. Рекомендуется перемешивание суспензии перед каждым отбором определенных объемов для проведения анализа.
11.3.2.4. Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию через бумажный фильтр.
11.3.3. Определение рабочей концентрации тест-сиcтемы "Эколюм"
11.3.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокс-10" (по инструкции к прибору) и записать это значение.
11.3.3.2. Добавить 0,1 мл исходной суспензии из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (pH 6,8-7,4; комнатная температура).
11.3.3.3. Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции.
11.3.3.4. Рекомендуется, чтобы интенсивность свечения биосенсора находилась в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 100-500 раз. Если величина свечения намного больше верхнего предела, то рекомендуется разбавить исходную суспензию дистиллированной водой и повторить измерение.
12. Процедура биотестирования
12.1. Определение индекса токсичности
При определении индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб. Рекомендуется иметь не менее трех повторностей опытной пробы. Для большей достоверности данных число повторностей опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений. Существует два варианта измерений. Первый вариант - измеряется контрольная проба, и прибор запоминает значение интенсивности свечения. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы, усредненное значение индекса токсичности и погрешности измерения. Второй вариант - измеряются последовательно три (или более) пары контроль-опыт. В каждой паре прибор автоматически фиксирует индекс токсичности и в конце измерения выдает значения усредненного индекса токсичности пробы и значения погрешности измерения. Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе может быть произвольным, но равным в контроле и исследуемой пробе.
12.1.1. При стандартном анализе отбирают из флакона по 0,1 мл рабочей суспензии биосенсора и добавляют в три кюветы от люминометра контрольные и три (или более - до 10) кюветы для пробы. Добавляют в контрольные кюветы по 0,9 мл дистиллированной воды (pH 6,8-7,4). Добавляют в остальные кюветы по 0.9 мл опытной пробы, замечают время экспозиции и через определенный интервал измеряют интенсивность биолюминесценции.
12.1.2. Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности проводят с помощью прибора "Биотокс-10" согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.
12.2. Определение токсикологических параметров пробы, ЕС20 и ЕС50
Эта операция предназначена для быстрого выяснения вопроса, при каких объемах исходного слаботоксического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях высокотоксичный образец станет нетоксичным (величины менее ЕС20).
При этом происходит регистрация величины индекса токсичности измеряемого образца.
ЕС50 есть эффективный объем образца вызывающий тушение свечение биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец высокотоксичен. ЕС20 есть эффективный объем образца, который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен. Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец нетоксичен.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием достаточно известной в токсикологии гамма-функции. Гамма-функция () представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой , где 0 и соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец высокотоксичен. График -функции в логарифмических координатах концентрации есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет автоматически представлять величины для каждой пробы, а также вычисляет величины ЕС20 и ЕС50 (см. описание к прибору "Биотокс-10").
12.2.1. Рекомендуется перед измерением коэффициентов ЕС убедиться при измерении токсичности неразбавленной пробы, что величина для данной пробы не превышает значения 25. В случае если величина больше, может увеличиться погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу дистиллированной водой до указанного предела и учесть предварительное разбавление.
12.2.2. После вывода прибора в режим измерения ЕС (см. инструкцию к прибору) для измерения параметров исследуются 4 пробы: исходная (обозначена на дисплее прибора как 1:1) и 3 пробы, получаемые путем последовательного разбавления в два раза исходной пробы дистиллированной водой в отношениях 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4-х проб автоматически определяется -функция, значения которой заносятся в оперативную память микроконтроллера прибора. По данным этих 4-х измерений микроконтроллер при нажатии специальных кнопок клавиатуры управления производит автоматически вычисление коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее.
При интенсивности биолюминесценции любого из 4-х образцов больше контроля или равным ему вычисление параметров ЕС не производится. Если исходный образец имеет интенсивность биолюминесценции больше контроля, то для изучения параметров ЕС его необходимо концентрировать. В случае если исходный образец имеет интенсивность биолюминесценции меньше контроля, но последние разбавления дают активацию свечения, рекомендуется сильно уменьшить степень разбавления исходного образца.
12.3. Определение соответствие качества различных материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции, материалы, применяемые в водоснабжении и в качестве материалов, контактирующих с пищевыми продуктами
12.3.1.Необходимо иметь банк данных по действию на биосенсор "Эколюм" продукции конкретного производителя, которая производителем представлена как качественная и это подтверждено медицинскими или другими исследованиями. Берутся результаты анализа как минимум 5 экземпляров данной продукции в трех повторностях. На основании результатов вычисляется доверительный интервал изменения индекса токсичности качественных образцов продукции.
12.3.2. Извлечение водорастворимых форм химических соединений из материалов и изделий проводят как указано в п.11.
12.3.3. Подготовку тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10" проводят согласно п.11.
12.3.4. Приготовление контрольных проб. Отбирают по 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и добавляют в кюветы от люминометра по 0,9 мл дистиллированной воды (pH 6,8-7,4).
12.3.5. Приготовление опытных проб. Отбирают по 0,1 мл рабочей суспензии биосенсора и добавляют в кюветы от люминометра по 0,9 мл водного экстракта из качественных материалов и изделий данного завода-изготовителя.
12.3.6. Замечают время экспозиции и через определенный интервал измеряют интенсивность биолюминесценции биосенсора всех проб. Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности пробы проводят с помощью прибора "Биотокc-10" согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.
Если величина индекса токсичности больше 60, то рекомендуется развести измеряемые пробы дистиллированной водой (pH 6,8-7,4), чтобы индекс токсичности был в диапазоне 20-50. Полученный результат измерения среднего индекса токсичности (с учетом погрешности измерения) заносят в банк данных.
12.3.7. Проводят измерение индекса токсичности любого материала и изделия согласно п.п.10.3.2.-10.3.6 в не менее чем трех повторностей. В случае большого разброса данных число повторностей рекомендуется увеличить.
12.3.8. Сравнивают полученный результат измерения среднего индекса токсичности (с учетом погрешности измерения) измеряемой продукции с доверительным интервалом изменения индекса токсичности эталонных образцов данной продукции, внесенных в банк данных. Если полученные результаты величины индекса токсичности находятся в пределах доверительного интервала, то продукт признается качественным. Если полученные результаты величины индекса токсичности выходят за пределы доверительного интервала, то продукт признается некачественным.
13. Обработка и оценка результатов
13.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности “” (прибор "Биотокс-10" позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс-10".
13.2. Индекс токсичности “” есть величина безразмерная, и определяется по формуле , где и соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности “” по формуле 
, где 
-
- повторности (до 10) опытной пробы. Величины , 
и получают из трех параллельных измерений контроль-опыт в короткий промежуток времени или при измерении в последовательности контроль, и затем серия опытных образцов.
13.3. В случае наличия токсичности пробы ("" равно или больше 20) можно определить насколько это связано со значениями pH исследуемого раствора. Для этого измеряют pH пробы и, если величина рН находится за пределами 6.5-8.0, приводят pH до значений 6.8-7.4 и повторяют измерение токсичности.
13.4. В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "" делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
13.5. Представленные прибором показатели параметров ЕС показывают насколько надо разбавить анализируемую пробу, чтобы достичь уровня токсичности (ЕС20) или острой токсичности (ЕС50).
13.6. По величине индекса токсичности и параметров ЕС анализируемые пробы классифицируются на три группы, представленные в таблице.
Таблица 1
|
Группы |
Величина индекса токсичности " |
Величина параметра ЕС |
Степень токсичности пробы |
|
1 |
меньше 20 |
концентрация пробы, меньше величины ЕС20 |
допустимая степень токсичности |
|
2 |
равна 20 и меньше 50 |
концентрация пробы, меньше величины ЕС50 и больше или равна ЕС20 |
образец токсичен |
|
3 |
равна или больше 50 |
концентрация пробы, равная или больше величины ЕС50 |
высокая токсичность образца |
13.7. Прибор серии "Биотокс-10" обеспечивает в автоматическом режиме вычисление усредненного значения индекса токсичности, погрешности измерения индекса токсичности и гамма-функции исследуемой пробы (токсикологических характеристик - ЕС20 и ЕС50).
13.8. Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1).
14. Контроль погрешности методики токсикологического анализа
14.3. Контроль качества оценки токсичности проводится по определению чувствительности тест-системы "Эколюм" к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водному (ZnSО
7H
О), растворенному в дистиллированной воде (pH 6,8-7,4). Концентрация модельного токсиканта, при действии которого через 30 минут экспозиции интенсивность биолюминесценции ингибируется не менее чем на 50%, должна быть не более 7.0 мг/дм
цинка сернокислого.
Испытания проводят в соответствии с прописью методики в трех независимых опытах. Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая токсичность, находится в интервале 6.0-7.0 мг/дм цинка сернокислого, то чувствительность тест-объекта соответствует необходимым требованиям. Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая токсичность, не находится в данном интервале, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если ошибки при проведении опытов исключены, необходимо сменить исходный материал.
14.2. Оперативный контроль сходимости проводится при анализе каждой рабочей пробы.
15. Форма представления результатов анализа
Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:
± s, при P=0,95
- среднее арифметическое определений.
За результат анализа () принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности вычисляется по формуле =100(1контр.-1опыт)/1контр., где 1контр. и 1опыт соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.
Среднее квадратичное отклонение (
) результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:
где 
-
-й результат определений, 
- число параллельных определений.
Среднее арифметическое результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:
Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.
Библиографические данные
1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.
4. СанПиН 2.3.2.1078-00 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
6. СанПиН 42-123-4240-86. "Допустимые количества миграции химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми средами и методы их определения".
7. Данилов B.C., Егоров Н.С. Бактериальная биолюминесценция. Изд-во МГУ, М., 1985 г.
8. Методические указания по осуществлению государственного санитарного надзора за устройством и содержание жилых зданий N 2295-81, утвержденные МЗ СССР 24.02.81. М., 1981.
9. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. М., 1999.
10. МР N 11-131-09. Методические рекомендации "Определение интегральной токсичности химических веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста" от 8 июня 2000 г.
11. Оценка токсичности материалов, изделий и объектов окружающей среды на альтернативных биологических моделях (экспресс-методы).- М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 220 с.
12. Скачков В.Б. Обоснование и разработка экспресс-методов контроля гигиенической безопасности среды обитания. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. Москва. 2002 - 46 с.
Приложение 1 (рекомендуемое)
|
Наименование учреждения, выдавшего протокол |
ИСПЫТАТЕЛЬНЫЙ ЦЕНТР |
|||
|
Аттестат аккредитации |
||||
|
ПРОТОКОЛ N
|
||||
|
Наименование учреждения/отдела |
||||
|
Вид испытаний |
Токсикологической оценки |
N образца |
||
|
От " " 200_г. |
||||
|
Наименование образца: |
||||
|
Наименование предприятия-изготовителя: Упаковка, маркировка, описание образца: НД на методы испытаний |
||||
РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ
|
Показатели |
Критерии оценки |
Вывод о степени токсичности пробы |
|
Индекс токсичности |
меньше 20 - допустимая степень токсичности; от 20 до 50 - образец токсичен; равно или больше 50 - образец сильно токсичен |
|
|
Величина ЕС |
концентрация пробы, меньше величины ЕС20 - допустимая степень токсичности; концентрация пробы, меньше величины ЕС50 и больше или равна ЕС20 - образец токсичен; концентрация пробы, меньше величины ЕС50 и больше или равна ЕС20 - образец сильно токсичен. |
|
Испытания проведены: ………………………………………………………. |
|||
|
(Ф.И.О. лиц, проводивших испытание) |
(Дата) |
||
|
Заключение, рекомендации:
Результаты испытаний распространяются только на представленные образцы. |
||
|
Руководитель ИЛЦ |
………………………………………………………………...... |
|
|
(Ф.И.О.) |
(Дата) |
|