МР 01.020-07 Определение токсичности воздушной среды с помощью биотеста "Эколюм"
МР 01.020-07
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ С ПОМОЩЬЮ БИОТЕСТА "ЭКОЛЮМ"
1. Методические рекомендации разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (Ревазова Ю.А., Хрипач Л.В.), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (Данилов B.C., Князева Т.А.), ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора (Брагина И.В., Ластенко Н.С., Федосеева Т.А.).
2. С выходом настоящих методических рекомендаций утрачивают силу методические рекомендации "Оценка токсичности воздушной среды с помощью люминесцентного бактериального теста "Эколюм" от 8 июня 2000 г. МР N 11-1/132-09.
УТВЕРЖДЕНЫ Главным врачом ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Председателем Лабораторного Совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагиным 15 июня 2007 г.
1. Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает методику быстрого и количественного определения интегральной токсичности проб воздуха в лабораторных условиях с использованием в качестве тест-объекта биосенсор "Эколюм" и измерительного прибора серии "Биотокс-10". Тест-система реагирует на токсичные соединения разнообразной химической природы и смеси веществ.
Объектами исследования являются пробы атмосферного воздуха населенных пунктов, воздуха рабочей зоны и воздуха жилых и общественных зданий.
Документ предназначен для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и специальных служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.
Опасность загрязнения воздушной среды определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния прямо или косвенно на здоровье человека. Результаты обследования качества воздушной среды учитывают при определении и прогнозе степени ее опасности для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, оценке эффективности санитарно-противоэпидемических мероприятий и текущего санитарного контроля.
2. Нормативные ссылки
1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 года N 52 ФЗ в редакции Федерального закона от 22 августа 2004 года N 122 ФЗ.
5. Методические указания по осуществлению государственного санитарного надзора за устройством и содержанием жилых зданий. N 2295-81. Утв. Минздравом СССР 24.02.81.
3. Термины и определения
Санитарно-гигиенический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды.
Химическое загрязнение воздуха - изменение химического состава воздушной среды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности, вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для здоровья населения.
Токсичность - степень проявления вредного действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество окружающей среды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности объектов при их использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе.
Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности исследуемого объекта. Среди тест-параметров наиболее часто используют выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимическою, морфологического, поведенческого или другого функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты , регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемом объекте, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
4. Принцип методики
Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждения (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
При изучении токсикологических свойств объектов окружающей среды люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на животных, культуры клеток человека и другие известные биотесты.
Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
Острое токсическое действие исследуемой пробы на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-ти минутный период экспозиции. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде безразмерной величины - индекса токсичности "
", равной отношению
,
где 
и 
соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом.
Методика предусматривает три пороговых уровня индекса токсичности:
- допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности меньше 20;
- образец токсичен: индекс равен или больше 20 и меньше 50;
- образец сильно токсичен: индекс токсичности равен или более 50.
5. Характеристики погрешности
Метрологические характеристики биотеста в соответствии с аттестацией 4/7-93, проведенной органами Госстандарта: сходимость результатов определения тест-параметра - 5%, воспроизводимость результатов определения тест-параметра - 5%.
6. Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"
Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий или препараты бактериальной люциферазы, содержащиеся в среде инертных газов в стеклянных флаконах. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01. Биосенсор, содержащийся при температуре 2-4 °С, имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.
Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.
Портативный прибор "Биотокс-10" может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, и усредненной величины индекса токсичности; вычисление стандартного отклонения показателя токсичности. Прибор позволяет проводить определение исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом и компьютерную обработку данных измерения.
7. Оборудование, материалы, реактивы
1. Прибор серии "Биотокс-10", с набором кювет для измерения биолюминесценции объемом 1,5 мл, сертификат об утверждении типа средств измерений RU.C.31.003.A N 21703;
2. Лиофилизированный биосенсор "Эколюм", ТУ 2639-236-00209792-01;
3. Электроаспиратор с расходометром тип ЭА-1, ЭА-2, ПУ-ЭР/220, ПУ-ЭР/12 и подобные, ТУ 25-11.1591-81;
4. Весы лабораторные общего назначения, ГОСТ 24104;
5. рН-метр, ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;
6. Термометр лабораторный 0-55 °С, цена деления шкалы - 0,5 °С, ГОСТ 215;
7. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474;
8. Термостат суховоздушный электрический ТС 80 МУ 4.2, ТУ 64-1-1382-76Е;
9. Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание (-18±1 °С) и хранение проб (2-4 °С);
10. Часы сигнальные, ТУ 25-07-57;
11. Подставка (из пластика, дерева) с углублением для пенициллиновых пузырьков или измерительных кювет, на которых можно разместить не менее 12 кювет;
12. Пипетки автоматические дозаторы любого типа объемом 0,02-0,5 мл ±1,0%;
13. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл второго класса точности, ГОСТ 1770;
14. Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл, ГОСТ 25336;
15. Пипетки объемом 0,5 и 1,0 мл, ГОСТ 29227;
16. Флаконы и банки, стеклянные с навинчивающейся крышкой или с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100 мл;
17. Воронки лабораторные, ГОСТ 25336;
18. Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ (красная, белая ленты), ТУ 6-09-1678;
19. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709;
20. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328;
21. Кислота соляная, ГОСТ 3118;
22. Кислота серная, ГОСТ 4204;
23. Спирт этиловый, ТУ 6-091710;
24. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174;
25. Бумага индикаторная универсальная для измерения рН;
26. Фильтры АФА-ХА-20.
8. Условия безопасного проведения работ
8.1. При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
8.2. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
8.3. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
8.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
8.5. Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.
8.6. Хранить тест-культуру "Эколюм" в холодильнике при температуре от -18 °С до 2-4 °С, следует беречь культуру лиофилизированных бактерий от нагревания и резкой смены температуры.
9. Требования к квалификации лиц, проводящих биотестирование
Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант.
10. Условия выполнения измерений
Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.
Температура окружающего воздуха в лаборатории от 18 до 25 °С. Относительная влажность воздуха 80±5%. Атмосферное давление 84-106 кПа (630-800 мм рт.ст.).
При использовании электроприборов частота переменного тока 50±1 Гц. Напряжение сети 220±10 В.
Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.
11. Подготовка к проведению измерений
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, пробоотборников, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание каких-либо химических веществ в исследуемую пробу.
11.1 Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования
Обычно используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2-3 часа посуда оставляется, затем она тщательно промывается водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3-4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу при 105 °С в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться закрытой стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.
11.2. Отбор, транспортировка, хранение и подготовка проб
11.2.1. Отбор проб, их хранение и транспортировка осуществляется в соответствии с ГОСТ 17.2.3.01-86 и РД 52.04.186-89.
11.2.2. Отбор твердых и аэрозольных частиц атмосферного воздуха или воздуха жилых помещений и общественных зданий производится на фильтры АФА-ХА-20 в объеме 10 м
с помощью стандартных электроаспираторов с расходометром типа ПУ-ЭР/220, ПУ-ЭР/12, ЭА-1, ЭА-2 и других, рекомендованных Роспотребнадзором для проведения санитарно-гигиенического контроля атмосферного воздуха, воздуха промышленной зоны и воздуха жилых и общественных зданий.
Можно готовить пробу путем продувания исследуемого воздуха в стеклянном сосуде с 10 мл дистиллированной воды в течение 20 минут.
При отборе проб атмосферного воздуха в протоколе опытов необходимо фиксировать метеоусловия (температуру и влажность воздуха, направление и силу ветра, атмосферное давление). После отбора проб фильтры следует поместить в чистые стеклянные бюксы или стаканы с закрывающимися пробками.
Все последующие этапы оценки токсичности желательно проводить в максимально сжатые сроки. При необходимости фильтры можно хранить в темноте при температуре 2-4 °С в течение суток.
11.2.3. Фильтры, извлеченные из фильтродержателей, помещают в стеклянный стакан объемом 10 мл, заливают дистиллированной водой (рН 7,0-7,4) объемом 5 мл так, чтобы вода покрывала весь фильтр, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого отбирают определенный объем воды (не менее 5 мл) и проводят анализ.
11.2.4. Берут чистый фильтр, извлекают его из фильтродержателя, помещают в стеклянный стакан объемом 10 мл, заливают дистиллированной водой объемом 5 мл так, чтобы вода покрывала весь фильтр, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого отбирают определенный объем воды и используют его в анализе в качестве контрольного раствора.
11.2.5. При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре тест-объекта. Температурный оптимум для биотеста составляет 15-25 °С.
11.3. Подготовка тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"
11.3.1. Подготовку прибора "Биотокс" проводят в соответствии с методикой поверки прибора и инструкцией по эксплуатации.
11.3.2. Реконструкция биосенсора.
11.3.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным биосенсором. Добавить 10 мл дистиллированной воды (комнатная температура, рН 6,8-7,4) - получают исходную суспензию биопрепарата. В случае необходимости рН дистиллированной воды доводят до нужного диапазона подщелачиванием раствором NaOH или подкислением раствором HCl. При отсутствии такой воды или ее плохого качества можно использовать стандартный физиологический раствор.
11.3.2.2. Выдержать суспензию биопрепарата в течение 30 минут, периодически перемешивая.
11.3.2.3. Держать флакон с суспензий можно на лабораторном столе при нормальном освещении. Рекомендуется перемешивание суспензии перед каждым отбором определенных объемов для проведения анализа.
11.3.2.4. Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.
11.3.3. Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм".
11.3.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокc" (по инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.
11.3.3.2. Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (рН 7,0-7,4, комнатная температура).
11.3.3.3. Вставить кювету с биореагентом в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции за 10 сек. Записать эту величину.
11.3.3.4. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 100-500 раз. Если обнаруженная величина меньше интервала, то увеличить добавку биосенсора (например, добавлять 0,2 мл и т.д.) и повторить измерение. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.
12. Процедура биотестирования. Определение индекса токсичности
При определении индекса токсичности необходимо проводить параллельное измерение контрольных и опытных проб. Рекомендуется иметь по три контрольной и три опытной пробы. Для большей достоверности данных число повторностей опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений. Существует два варианта измерений. Первый вариант - измеряется контрольная проба, и прибор запоминает эту величину. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы, усредненное значение индекса токсичности и погрешности измерения. Второй вариант - измеряются последовательно три (или более) пары контроль-опыт. В каждой паре прибор автоматически фиксирует индекс токсичности и в конце измерения выдает значения усредненного индекса токсичности пробы и значения погрешности измерения. Объем добавляемой суспензии бактерий к пробе может быть произвольным, но равным в контроле и исследуемой пробе.
12.1.1. В стандартном анализе отбирают по 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и добавляют в три кюветы от люминометра контрольные и три (или более) кюветы для пробы. Затем добавляют в контрольные кюветы по 0,9 мл дистиллированной воды, которая была в контакте с контрольным фильтром. Добавляют в остальные кюветы опытную пробу по 0,9 мл, замечают время экспозиции и через определенный интервал времени измеряют интенсивность биолюминесценции бактерий и индекс токсичности на приборе "Биотокс".
12.1.2. Измерение интенсивности биолюминесценции и индекса токсичности проводят с помощью прибора "Биотокс" согласно инструкции по эксплуатации прибора в стандартном варианте через 5 и 30 минут экспозиции. В протокол вносится наибольшая величина индекса токсичности этих двух измерений.
13. Обработка и оценка результатов
13.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "" (прибор "Биотокс" позволяет автоматически вычислять индекс токсичности). Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора "Биотокс".
13.2. Индекс токсичности "" есть величина безразмерная, и определяется по формуле , где и соответственно интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемого раствора с тест-объектом. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности "" по формуле 
, где 
- повторности проб. Величины 
, 
и 
получают из трех параллельных измерений контроль-опыт в короткий промежуток времени или при измерении в последовательности контроль, и затем серия опытного образца (до 10 параллельных измерений).
13.3. В случае наличия токсичности пробы ( равно или больше 20) можно определить насколько это связано со значениями рН исследуемого раствора. Для этого измеряют рН пробы и, если величина рН находится за пределами 6,5-8,0, приводят pH до значений 7,0-7,4 и повторяют измерение токсичности.
13.4. В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "" делается вывод о допустимой токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
13.5. По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на три группы
Таблица 1
|
Группы |
Значение " |
Степень токсичности пробы |
|
1 |
меньше 20 |
допустимая степень токсичности |
|
2 |
от 20 до 50 |
образец токсичен |
|
3 |
равно или больше 50 |
образец высоко токсичен |
13.6. Прибор серии "Биотокс-10" обеспечивает в автоматическом режиме вычисление усредненного значения индекса токсичности и погрешности измерения индекса токсичности.
13.7. Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1*).
_______________
* Приложение N 1 в бумажном оригинале не приводится. - Примечание изготовителя базы данных.
14*. Контроль погрешности методики токсикологического анализа
13.1*. Контроль качества оценки токсичности проводится по определению чувствительности тест-системы "Эколюм" к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водному (ZnSO
7H
O), растворенному в дистиллированной воде (pH 6,8-7,4). Концентрация модельного токсиканта, при действии которого через 30 минут экспозиции интенсивность биолюминесценции ингибируется не менее чем на 50%, должна быть не более 7,0 мг/дм цинка сернокислого.
Испытания проводят в соответствии с прописью методики в трех независимых опытах. Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая острую токсичность, находится в интервале 6,0-7,0 мг/дм цинка сернокислого, то чувствительность тест-объекта соответствует необходимым требованиям. Если концентрация модельного токсиканта, вызвавшая острую токсичность, не находится в данном интервале, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если ошибки при проведении опытов исключены, необходимо сменить исходный материал.
13.2*. Оперативный контроль сходимости проводится при анализе каждой рабочей пробы.
________________
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
15. Форма представления результатов анализа
Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:
, при 
=0,95
- среднее арифметическое определений.
За результат анализа () принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности вычисляется по формуле 
, где 
и 
соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.
Среднее квадратичное отклонение (
) результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:
,
где 
- 
-й результат определений, 
- число параллельных определений.
Среднее арифметическое результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:
.
Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.
/ Федеральная служба по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека. - М., 2007