МР 2.3.2.2327-08 Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности (с атласом значимых микроорганизмов)

4.3.2.1 Питьевую воду рекомендуется предварительно выдержать на свету в течение суток, прокипятить в открытом сосуде 30 мин и охладить до комнатной температуры. Необходимо контролировать активную кислотность воды, которая должна составлять 7,2-7,6 ед. рН.

Подготовленную воду используют для приготовления питательных сред и растворов для разведений.

4.3.2.2 Использование дистиллированной воды для приготовления растворов, реактивов и питательных сред должно быть оговорено в каждом конкретном случае и сопровождаться обязательным контролем рН.

4.3.2.3 При использовании воды для приготовления разведений ее разливают в пробирки по 10 см или в колбы по 93 см и стерилизуют при температуре (121±1) °С в течение (20±1) мин.

20 г трехзамещенного лимоннокислого натрия растворяют в 1 дм дистиллированной воды, разливают в пробирки по 10 см или в колбы по 93 см и стерилизуют при (121±2) °С в течение (15±1) мин.

4.4.1.1 Приготовление насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового

4.4.1.2 Приготовление водно-спиртового раствора кристаллического фиолетового

4.4.1.3 Приготовление раствора Люголя

4.4.1.4 Приготовление карболового раствора фуксина Циля

4.4.1.5 Приготовление водно-спиртового раствора фуксина (раствора Пфейфера)

К 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят непосредственно перед использованием.

4.4.2.1 Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого для окрашивания микропрепаратов

4.4.2.2 Приготовление краски для препаратов

К 30 см основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100 см дистиллированной воды и 1 см раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/дм.

4.5.5.1 Приготовление раствора неомицина

0,5 г неомицина (сульфата или основания) растворяют в 500 см стерильной дистиллированной воды и кипятят в течение 2-3 мин. При использовании неомицина в таблетированной форме его предварительно тщательно растирают в профламбированной ступке. Массовая концентрация неомицина в растворе - 1,0 г/дм.

4.5.5.2 Приготовление раствора диклосациллина

0,025 г диклосациллина растворяют в 50 см дистиллированной воды, полученный раствор стерилизуют фильтрацией. Срок хранения раствора - 15 сут при 4°С.

4.6.1.1 Определение активной кислотности (рН) питательных сред

Определение активной кислотности (рН) питательных сред проводят потенциометрическим методом с помощью анализатора потенциометрического для контроля рН по прилагаемым инструкциям.

Ориентировочное определение активной кислотности (рН) питательных сред может проводиться с помощью индикаторных бумажек или готового универсального индикатора.

4.6.1.2 Контроль качества рабочих питательных сред

Качество вновь приготовленных питательных сред проверяют путем параллельного посева одних и тех же проб на новую среду и ранее используемую. Результат считается удовлетворительным при получении данных одного порядка.

Контроль стерильности рабочих питательных сред осуществляют путем термостатирования пробы среды при 37 °С в течении 48 ч. Если после термостатирования на средах отсутствуют признаки роста, то среда считается стерильной.

4.6.1.3 Хранение рабочих питательных сред

Если особые условия хранения конкретной рабочей питательной среды не оговорены в инструкции по ее применению, то среды хранят в холодильнике не более 3 мес или при температуре 18-23 °С не более 1 мес при условии сохранения внешнего вида среды.

4.6.2.1 Среда КМАФАнМ - плотная основная среда для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Приготовление

(50±5) г сухой среды вносят в (1000±50) см холодной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания, и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (при наличии осадка). В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до рН (7,3±0,1) ед. Среду вновь доводят до кипения, разливают в колбы или пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

Готовую питательную среду проверяют на стерильность. Отсутствие изменений в питательной среде после выдержки 72 ч при (30±1) °С свидетельствует о стерильности питательной среды.

Использование

Рабочую среду непосредственно перед применением расплавляют, помещая посуду со средой в водяную баню. Расплавленную среду осторожно охлаждают до температуры 40-45 °С, не допуская вспенивания. В чашку Петри питательную среду вносят в количестве, необходимом для создания слоя среды не менее 2 мм (обычно требуется 10-15 см агаровой среды).

О наличии роста судят по появлению на питательной среде видимых колоний микроорганизмов.

Рекомендации к применению

Среда используется для оценки санитарно-гигиенического состояния молока и молочных продуктов, материалов и компонентов, воды, оборудования, воздуха.

Изменяя условия культивирования на среде КМАФАнМ, определяют следующие группы микроорганизмов:

• общее количество мезофильных микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 29-31 °С, продолжительность - 72 ч);

• общее количество термофильных микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 42-45 °С, продолжительность - 72 ч);

• общее количество психротрофных микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 7 °С, продолжительность - 7-10 сут).

Среда может быть использована для определения:

- липолитических микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 20-23 °С, продолжительность - 5-6 сут).

Для определения липолитических микроорганизмов среду КМАФАнМ используют в качестве основы, при этом предварительно на дно чашки Петри наливают стерильный расплавленный говяжий жир до образования сплошного тонкого слоя. Колонии липолитических бактерий, разлагающих жир, образуют на среде зоны просветления;

- протеолитических микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 30 °С, продолжительность - 48 ч).

Для определения протеолитических микроорганизмов среду КМАФАнМ используют в качестве основы, при этом предварительно на дно чашки Петри наливают 1 см стерильного обезжиренного молока. Колонии протеолитических бактерий, разлагающих белок, образуют на среде зоны просветления;

- споровых аэробных микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 30 °С, продолжительность - 48-72 ч).

Для определения споровых аэробных микроорганизмов необходимо перед посевом прогреть посевной материал или соответствующие разведения при температуре 87 °С в течение 10 мин;

- молочнокислых микроорганизмов в кисломолочных продуктах и закваске;

- ароматообразующих (цитратсбраживающих) заквасочных микроорганизмов (режимы культивирования: температура - 30 °С, продолжительность - 48-72 ч).

Для определения ароматообразующих (цитратсбраживающих) заквасочных микроорганизмов к 1 дм среды КМАФАнМ перед стерилизацией добавляют 10 г цитрата кальция. После термостатирования вокруг колоний ароматообразующих заквасочных микроорганизмов образуются зоны просветления.

4.6.2.2 Среда Кесслер для определения БГКП

А Жидкая среда Кесслер

Приготовление

4.6.2.3 Среда Кода - жидкая элективная среда для определения БГКП в объектах окружающей среды.

Приготовление

4.6.2.4 Глюкозопептонная среда (ГПС) или лактозопептонная среда (ЛПС) - жидкие элективные среды для определения БГКП в воде.

Приготовление

Среду готовят двух видов: концентрированную и нормальную.

Концентрированная среда

К 20 г сухой среды при постоянном перемешивании добавляют 100 см воды с температурой 90-95 °С. Контролируют активную кислотность готовой питательной среды и в случае необходимости корректируют ее 20-30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до величины 7,2-7,6 ед. рН. Готовую среду разливают по 10 см в колбы и по 1 см в пробирки с ватными пробками или тампонами.

Среда нормальной концентрации

К 10 см концентрированной питательной среды добавляют 90 см воды. Готовую среду разливают по 10 см в пробирки с поплавками или комочками ваты.

Среды стерилизуют в автоклаве при 112 °С (0,5 атм) в течение 12 мин.

Признаками роста БГКП является помутнение, газообразование и изменение окраски сред с буровато-зеленой (для концентрированной) или голубой (среда нормальной концентрации) на желтую.

Рекомендации к применению

Среды служат для определения БГКП в воде в соответствии с ГОСТ Р 51232, ГОСТ 18963 и МУК 4.2.1018.

4.6.2.5 Среда АЖФК (агар желчный фиолетово-красный) - плотная элективная среда для количественного определения БГКП в молоке и молочных продуктах.

Приготовление

4.6.2.6 Среда Эндо - плотная дифференциально-диагностическая среда для дифференциального определения и идентификации БГКП при контроле санитарного состояния производства и качества готового продукта на предприятиях пищевой промышленности.

Приготовление

4.6.2.7 Среда агаровая для определения дрожжей и плесеней - плотная элективная среда для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах, а также для микробиологического контроля санитарного состояния производства.

Приготовление

4.6.2.8 Среда Сабуро - плотная питательная среда основного характера для анализа консервов на стерильность и определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах.

Приготовление

4.6.2.9 Среда СДА - полужидкая среда основного характера для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий при контроле молока, сухого молока, при исследовании сыров.

Приготовление

(50±5) г сухой среды вносят в 1 дм воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной или соляной кислоты до значения (7,3±0,1) ед. рН. Готовую среду разливают в пробирки по (12±1) см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2)° С в течение (15±1)мин.

Признаками роста являются изменение окраски среды с красной на желтую и образование газа.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

4.6.2.10 Среда ЛАССА - полужидкая дифференциально-диагностическая среда для определения спор и вегетативных клеток лактатсбраживающих маслянокислых бактерий.

Приготовление

(50±5) г сухой среды вносят в 1 дм воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (5,7±0,1) ед. рН. Готовую среду разливают в пробирки по (12±1) см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

Признаками роста являются изменение окраски среды с малиновой на соломенно-желтую и газообразование.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

4.6.2.11 Среда для определения бифидобактерий - плотная питательная среда основного характера для определения бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах, бифидосодержащих бактериальных концентратах и заквасках.

Приготовление

(50±5) г сухой среды вносят в 1 дм холодной воды, тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, и кипятят 3-5 мин. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (7,4±0,2) ед. рН. Среду разливают в пробирки по 20 см, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

Непосредственно перед применением пробирки с рабочей средой нагревают в водяной бане до кипения и выдерживают в течение (25±5) мин. По окончании тепловой обработки среду быстро охлаждают до температуры 40-45 °С. Посевы культивируют (72±2) ч при температуре (37±1) °С.

Рекомендации к применению

Среда предназначена для определения бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах, содержащих наряду с бифидобактериями молочнокислые микроорганизмы. Поэтому при проведении посева необходимо создавать анаэробные условия, проводя посев "в высокий столбик", и избегать взбалтывания среды и попадания внутрь столбика среды воздуха из пипетки.

Бифидобактерии на данной среде образуют непрозрачные белесые колонии в виде "дисков" или "гречишных зерен".

При определении бифидобактерий в продуктах со смешанной микрофлорой в готовые среды перед расплавлением рекомендуется вносить на 20 см среды 0,2 см раствора неомицина, приготовленного по 4.5.5.

4.6.2.12 Среда для культивирования бифидобактерий - полутвердая среда основного характера для культивирования бифидобактерий и дальнейшего их использования при производстве ферментированных молочных продуктов.

Приготовление

4.6.2.13 Водный агар

Приготовление

4.6.2.14 Стерильное обезжиренное молоко

Приготовление

Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см (возможно использование 10% восстановленного обезжиренного молока), закрывают ватными пробками и стерилизуют при (121±2) °С в течение (11±1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении молочнокислых микроорганизмов, а также микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью.

4.6.2.15 Среда для определения цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов - плотная питательная среда на основе среды КМАФАнМ, предназначенная для количественного определения цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов.

Приготовление

(50±5) г сухой среды КМАФАнМ вносят в (1000±50) см воды. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. При наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30% раствором гидроокиси натрия или 20% раствором молочной кислоты до значения (7,3±0,1) ед. рН. В расплавленную среду добавляют 10 г цитрата кальция, предварительно хорошо растертого в ступке. Среду, периодически перемешивая до равномерного распределения осадка, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении цитратсбраживающих ароматообразущих молочнокислых микроорганизмов закваски, БК и ферментированных молочных продуктов. При определении ароматообразующих микроорганизмов вокруг их колоний образуются зоны просветления.

4.6.2.16 Молочно-солевой агар - плотная питательная среда, предназначенная для определения солеустойчивых микроорганизмов.

Приготовление

4.6.2.17 Среда для определения пропионовокислых бактерий - плотная питательная среда, предназначенная для количественного определения пропионовокислых бактерий.

Приготовление

В (1000±50) см воды вносят 30 г пептона, 1 г дрожжевого автолизата, 20 г агара. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят до расплавления агара, не допуская пригорания. Добавляют 20 см 40% молочной кислоты. В полученной среде проверяют активную кислотность и доводят ее 20-30% раствором гидроокиси натрия до значения (7,1±0,1) ед. рН. Среду перемешивают, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении пропионовокислых бактерий в производственной закваске, БК и ферментированных молочных продуктах. Пропионовокислые бактерии при росте на этой среде дают кремовые колонии в виде "дисков" и "гречишных зерен".

5.6.2.1 Для количественной оценки аэробной микрофлоры исследуемых объектов в подготовленную чашку Петри на поверхность плотной питательной среды вносят 0,1-0,2 см исследуемого материала (объем зависит от конкретных условий) и стерильным шпателем Дригальского втирают посевной материал в питательную среду равномерно по всей поверхности.

5.6.2.2 Для оценки видовой (групповой) принадлежности микрофлоры, содержащейся в материале, поверхностный посев проводят с использованием бактериологической петли. При этом материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно и по линиям, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микроорганизмов.

6.1.1.1 Метод определения редуктазы с резазурином

Сущность метода

Метод основан на восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми микроорганизмами в молоко. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность молока-сырья.

Проведение анализа

Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения (средняя продолжительность бактерицидной фазы неохлажденного молока).

В пробирки наливают по 1 см рабочего раствора резазурина и по 10 см исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и перемешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37±1) °С.

При отсутствии редуктазника можно использовать водяную баню, помещенную в термостат с температурой (37±1) °С.

Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру (37±1) °С поддерживают в течение всего времени определения.

Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от попадания прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой).

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа.

Показания снимают через 1 и 1,5 ч.

Появление окрашивания молока в пробирках, исчезающее при встряхивании, не учитывают.

По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин.

Обработка результатов

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из четырех классов, указанных в таблице 4 и приложении В .

Таблица 4 - Класс молока по редуктазной пробе

Молоко, имеющее через 1,5 ч окраску, соответствующую I классу, относят к высшему классу.

6.1.1.2 Метод определения редуктазы с использованием микробитестов с резазурином

Микробитесты с резазурином предназначены для определения уровня общей бактериальной обсемененности молока-сырья при проведении редуктазной пробы.

Микробитесты с резазурином представляют собой полоски бумаги фиолетового цвета, которые необходимо хранить в светонепроницаемых пакетах, а при работе предохранять от действия солнечного света. Анализ следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения.

Для проведения анализа необходимо вскрыть упаковку с микробитестами профламбированными ножницами, достать из нее микробитест и поместить его в стерильную пробирку, добавить 10 см исследуемого молока, закрыть стерильной резиновой пробкой и перемешать путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Затем пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37±1) °С.

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа.

Показания снимают через 1 и 1,5 ч.

По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин.

Обработка результатов

В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из четырех классов в соответствии с таблицей 4 и приложением В .

6.1.2.1 Метод определения ИВ с индикатором резазурином

Сущность метода

Метод основан на восстановлении резазурина при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам микроорганизмов вида Streptococcus thermophilus.

Приготовление культуры термофильного стрептококка для определения ингибирующих веществ

Из сухой закваски

Для восстановления активности культуры 100 см обезжиренного молока стерилизуют при (121±1) °С в течение 10-15 мин и охлаждают до 42-43 °С. Во флакон с сухой закваской термофильного стрептококка добавляют 5-7 см стерилизованного молока и тщательно перемешивают. Содержимое флакона вносят в молоко, подготовленное как указано выше, и перемешивают.

Заквашенное молоко термостатируют при температуре (43±2) °С в течение 12-18 ч до образования сгустка, после чего закваску охлаждают и используют для приготовления коллекционной тест-культуры.

Для приготовления коллекционной тест-культуры в пробирку с 10 см стерильного обезжиренного молока вносят 1 петлю культуры и выдерживают в термостате при (43±2) °С в течение 16-18 ч. Коллекционную тест-культуру хранят при 6-9 °С и перевивают через 1-14 сут.

Через 3-4 пересадки культуру снова готовят из сухой закваски. Допускается использовать культуру дольше, если она не утратила своей активности и по микроскопическому препарату соответствует требованиям (продолжительность сквашивания при перевивке 16-18 ч, сгусток плотный; консистенция однородная, допускается мягкая крупитчатость или вязкая; в поле зрения микроскопа в препарате тест-культуры - диплококки одиночные или собранные в цепочки).

Рабочую тест-культуру готовят из коллекционной в пробирках или бутылочках - в зависимости от необходимого количества. В пробирку с 10 см или бутылочку со 100 см стерильного обезжиренного молока вносят 1 петлю коллекционной тест-культуры и выдерживают в термостате при (43±2) °С в течение 16-18 ч до образования сгустка.

Для проведения анализа используют 1-2 суточную культуру при условии хранения ее в холодильнике при 6-8 °С.

Приготовление из сухого бактериального препарата "Интест"

При приготовлении рабочей культуры из сухого бактериального препарата "Интест" во флакон с препаратом добавляют стерильной пипеткой 10 см стерильной или кипяченной дистиллированной воды, подогретой до температуры (45±1) °С. Флакон закрывают пробкой и его содержимое тщательно перемешивают до получения однородной взвеси.

Полученную бактериальную суспензию используют для проведения анализов спустя 30 мин. За это время происходит набухание клеток.

Одна порция (флакон) культуры, приготовленной из препарата "Интест", предназначена для анализа 30 проб исследуемого молока.

При необходимости культуру хранят при температуре (6±2) °С и используют для проведения анализов в течение 72 ч.

Проведение анализа

В чистые пробирки (лучше стерильные) наливают по 10 см исследуемого молока и закрывают стерильными резиновыми пробками (лучше ватно-марлевыми, т.к. при последующей пастеризации резиновые пробки могут вылетать из пробирок). Оставшуюся часть пробы сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.

При наличии большого количества проб исследуемого молока анализ проводят сериями. Количество пробирок с исследуемым молоком в каждой серии не более 20.

Одновременно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают 10 см восстановленного препарата СКИВ. Для получения восстановленного препарата вскрывают колпачок и пробку флакона с сухим препаратом. Во флакон вносят пипеткой 10 см дистиллированной воды, подогретой до температуры (50±10) °С, закрывают пробкой и встряхивают до полного растворения.

Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой нагревают в водяной бане до (87±2) °С с выдержкой 10 мин, затем охлаждают до (47±1) °С.

Затем в пробирки стерильной пипеткой вносят рабочую тест-культуру в количестве 0,5 см, приготовленную из коллекционной тест-культуры, или 0,3 см тест-культуры, приготовленной из бактериального препарата "Интест". Ватно-марлевые пробки заменяют на стерильные резиновые пробки.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают трехкратным переворачиванием. Пробирки выдерживают в течение 1 ч 15 мин при температуре (46±1) °С в редуктазнике или водяной бане.

Затем в пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой вносят по 1 см основного раствора резазурина, подготовленного по 4.4.3, температурой (20±2) °С. Содержимое пробирок перемешивают путем двукратного переворачивания.

Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой выдерживают в течение 10 мин в редуктазнике или водяной бане с терморегулятором или водяной бане, помещенной в термостат при (46±1) °С.

Обработка результатов

При отсутствии в исследуемом молоке (и в контрольной пробе) ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь розовый или белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь окраску, характерную для молока 1 класса по цветовой шкале для определения класса по редуктазной пробе с резазурином (приложение В) .

6.1.2.2 Определение ИВ с индикатором метиленовым голубым

Сущность метода

Метод основан на восстановлении метиленового голубого при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам Streptococcus thermophilus.

Подготовка к анализу

Приготовление коллекционной и рабочей тест-культуры проводят по 6.1.2.1.

Приготовление водного раствора пептона

6.1.3.1 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром

Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis С953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски при их наличии.

Подготовка к анализу

Стеклянную бутылочку с питательной таблетированной средой "Delvotest" вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока с ампулами, содержащими агаровую среду со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis С953, необходимое количество ампул (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы хранят в холодильнике.

Отвинчивают колпачок стеклянной бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают обратно в бутылочку.

Проведение анализа

Соединительной частью шприца прокалывают фольгу, укупоривающую ампулы.

В каждую ампулу пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest". Бутылочку со средой плотно закрывают колпачком и хранят в дальнейшем при комнатной температуре.

Шприцем отбирают 0,1 см пробы молока и вносят в ампулу. Для каждой пробы молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.

Ампулы "Delvotest" помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч. Аналогично проводят контрольное определение, внося в ампулу 0,1 см предварительно восстановленного по 6.1.2.1. препарата СКИВ.

Обработка результатов

Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого.

Желтый цвет содержимого ампул с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.

Фиолетовый цвет содержимого ампул с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ (приложение В) .

Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают при получении отрицательных результатов после усиленных исследований молока на отсутствие соды, аммиака и перекиси водорода по ГОСТ 24065-ГОСТ 24067.

6.1.3.2 Определение антибиотиков с использованием Copan Test (СН АТК)

Сущность метода

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и сохранении окраски при их наличии.

Проведение анализа

С помощью ножниц отрезают необходимое количество тестовых пробирок, содержащих гелевую матрицу со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis, питательные вещества и индикатор рН.

С помощью специальной пипетки, находящейся в комплекте, добавляют 0,1 см исследуемого образца в тестовую пробирку. Для каждого образца используют отдельную пипетку.

Пробирки термостатируют в специальном термостате или в водяной бане при температуре (64±1) °С в течение 3 ч.

Обработка результатов

Изменение цвета среды в пробирке на желтый свидетельствует об отсутствии антибиотиков.

Цвет среды не изменился - антибиотики присутствуют.

Частичное изменение цвета среды (желто-фиолетовый) свидетельствует о концентрации ингибирующих веществ ниже чувствительности теста.

Для обработки результатов используют цветовую шкалу (приложение В) .

6.1.4.1 Визуальный метод определения количества соматических клеток в молоке

Сущность метода

Метод основан на взаимодействии сульфанола (поверхностно-активное вещество), входящего в состав препарата "Мастоприм", с соматическими клетками. В результате взаимодействия нарушается целостность клеточной оболочки и внутреннее содержимое клетки выходит наружу. В итоге в щелочной среде изменяется вязкость (консистенция) молока, что фиксируется визуально.

Подготовка к анализу

Приготовление водного раствора препарата "Мастоприм"

2,5 г препарата вносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 см и доливают до метки дистиллированной водой (или питьевой свежекипяченой водой), нагретой до температуры 30-35 °С. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка.

Срок годности раствора - 1 сут при температуре хранения 10-30 °С.

Проведение анализа

В луночку пластинки ПМК-1 (пластинки молочно-контрольные) вносят 1 см тщательно перемешанного молока и добавляют 1 см водного раствора препарата "Мастоприм". Молоко с препаратом интенсивно перемешивают деревянной, пластмассовой или стеклянной палочкой в течение 10 с. Полученную смесь из луночки на пластинке при непрерывном интенсивном перемешивании поднимают палочкой вверх на 50-70 мм, после чего в течение не более 60 с оценивают результаты анализа.

Обработка результатов

Количество соматических клеток в исследуемом молоке устанавливают по консистенции смеси молока с препаратом "Мастоприм" в соответствии с требованиями таблицы 5.

Таблица 5 - Количество соматических клеток в молоке, определяемое по консистенции смеси молока с препаратом "Мастоприм"

6.1.4.2 Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением вискозиметра

Сущность метода

Метод основан на взаимодействии сульфанола (поверхностно-активное вещество), входящего в состав препарата "Мастоприм", с соматическими клетками. В результате взаимодействия нарушается целостность клеточной оболочки и внутреннее содержимое клетки выходит наружу. В итоге в щелочной среде изменяется вязкость (консистенция) молока, что фиксируется с помощью вискозиметра.

Подготовка к анализу

Приготовление водного раствора препарата "Мастоприм"

3,5 г препарата вносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 см и доливают до метки дистиллированной водой (или питьевой свежекипяченой водой), нагретой до температуры 30-35 °С. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка.

Срок годности раствора - 1 сут при температуре хранения 10-30 °С.

Особенности проведения анализа

Во время исследования температура помещения, в котором проводятся исследования, должна быть 10-30 °С.

Кислотность исследуемого молока должна быть 16-21 °Т.

Проведение анализа

В сосуд прибора вносят 5 см водного раствора препарата "Мастоприм" и 10 см исследуемого молока, тщательно профильтрованного через четыре слоя марли и перемешанного.

Затем смесь молока с раствором препарата "Мастоприм" перемешивают в течение 30 с десятикратным отклонением рабочего сосуда от вертикальной оси на 145 °С при ручном или нажатием кнопки "Пуск" при автоматическом перемешивании. По окончании перемешивания определяют время вытекания смеси через капилляр.

После проведения анализа смеси для каждой исследуемой пробы молока сосуд следует два-три раза промыть дистиллированной водой и четыре-пять раз продуть с помощью резиновой груши. После очистки сосуда прибор считается подготовленным для дальнейших анализов.

Обработка результатов

Количество соматических клеток в исследуемом молоке устанавливают по времени вытекания смеси в соответствии с инструкциями по эксплуатации вискозиметрических анализаторов молока, которые должны быть аттестованы в установленном порядке.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать:

- для времени вытекания смеси от 12,0 до 18,0 с - 1 с;

- для времени вытекания смеси от 18,1 до 25,0 с - 2 с;

- для времени вытекания смеси от 25,1 до 31,0 с - 3 с;

- для времени вытекания смеси от 31,1 до 37,0 с - 4 с;

- для времени вытекания смеси от 37,1 до 46,0 с - 5 с;

- для времени вытекания смеси от 46,1 до 58,0 с - 6 с.

Предел допускаемой погрешности результатов измерений составляет 10% в интервале доверительной вероятности 0,95.

6.1.4.3 Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением счетчика соматических клеток

Сущность метода

Метод основан на окрашивании ядер соматических клеток специальным флуоресцентным реагентом. После воздействия света на окрашенное ядро клетки возникает сигнал флуоресценции, регистрируемый в виде изображения. По полученному изображению определяется количество соматических клеток. Результат количества соматических клеток отображается на дисплее прибора.

Средства измерения

Счетчик соматических клеток - прибор с применением прямой флуоресцентно-оптической технологии.

Особенности проведения анализа

Проба отбирается в специальный флакон после того, как сборное молоко тщательно перемешано (не менее 5 мин).

Перед измерением необходимо дождаться исчезновения пены в молоке.

Хранение проб молока: молоко до проведения анализа можно хранить в холодильнике не более 36 ч. Замороженное молоко не подлежит анализу данным методом.

Хранение кассет: кассеты хранят в закрытых пакетах в холодильнике. Кассеты нельзя подвергать воздействию прямого солнечного света. Реагенты, содержащиеся в кассетах, разлагаются под действием света за 1 мин.

Проведение анализа:

- нажать кнопку "On/Off" для включения или выключения прибора. Прибор оснащен функцией автоматического выключения, которая выполняется, если прибор в течение 2 мин не использовался;

- вынуть одну кассету из пакета;

- осторожно перемешать пробу, для этого несколько раз перевернуть флакон с молоком. Не трясти пробу молока перед анализом. Температура пробы должна быть в диапазоне от 10 °С до 40 °С;

- поместить всасывающее отверстие кассеты в пробу молока и нажать на поршень. Удостовериться, что молоко дошло до середины дорожки 3. Молоко вступит в реакцию с реагентами. В течение последующих 2 мин кассету необходимо поместить в прибор и запустить измерение;

- поместить кассету в прибор, при этом всасывающее отверстие кассеты должно быть слева. Закрыть крышку отсека для образца, т.к. открытая крышка может исказить результаты измерения;

- нажать кнопку "RUN" для выполнения измерений. Дисплей покажет прохождение различных этапов процедуры измерений;

- записать отображенное на дисплее значение количества соматических клеток в молоке;

- вынуть кассету из прибора. Выбросить использованную кассету в урну для мусора;

- после завершения измерения закрыть в приборе крышку отсека для образца.

Обработка результатов

Диапазон измерений счетчика составляет от 10000 до 4000000 соматических клеток/см, что на дисплее прибора отображается как 10-4000/ml. Следовательно, количество соматических клеток в исследуемом молоке соответствует показанию прибора, умноженному на 10 клеток/см.

1 г контрольного образца сычужного фермента с активностью 100 тыс. ед. растворяют в 100 см дистиллированной воды, нагретой до (30±1) °С, перемешивают и выдерживают не менее 15 мин. Хранят при температуре 4-10 °С в течении 2 сут.

Проведение анализа

В чисто вымытые широкие пробирки, хорошо просушенные и ополоснутые два-три раза молоком, из которого отбирают пробу, наливают около 30 см молока. Затем вносят в каждую пробирку по 1 см раствора сычужного фермента, хорошо перемешивают и ставят на 12 ч в водяную баню или термостат при температуре (38±1) °С, после чего вынимают из бани и проводят визуальную оценку.

Обработка результатов

По результатам визуальной оценки молоко-сырье относят к одному из трех классов, указанных в таблице 6.

Таблица 6 - Класс молока по сычужно-бродильной пробе

1 г контрольного образца сычужного фермента с активностью 100 тыс. ед. растворяют в 100 см дистиллированной воды, нагретой до (30±1) °С, перемешивают и выдерживают не менее 15 мин. Хранят при 4-10 °С в течение 2 сут.

Подготовка молока к испытанию

Молоко-сырье от индивидуальных сдатчиков, не подвергнутое температурной обработке, пастеризуют в лабораторных условиях. Для этого в колбу вместимостью 250 см помещают около 150 см молока, закрывают пробкой или фольгой. Колбу с молоком помещают в водяную баню с температурой (64±1) °С и выдерживают в течение 30 мин, после чего молоко в колбе охлаждают до температуры не выше 38 °С.

Проведение анализа

Пастеризованное молоко разливают в 4 пробирки по 30 см, доводят до температуры (38,0±0,5) °С в водяной бане или термостате. Затем в две пробирки вносят по 0,5 см, в другие две пробирки по 1,0 см раствора контрольного образца сычужного фермента, хорошо перемешивают и ставят на 1 ч при температуре (38,0±0,5) °С в водяную баню или термостат.

После выдерживания пробирок в водяной бане или термостате в течение установленного времени при заданной температуре оценивают качество полученного сгустка.

Обработка результатов

Для оценки молока на свертываемость сначала осматривают сгусток, поворачивая каждую пробирку на 180 °С. При хорошем или удовлетворительном качестве сгустка он не должен выпадать из пробирки. Затем осторожно с помощью шпателя отодвигают сгусток от стенки пробирки, переносят его в чашку Петри и характеризуют сгусток в соответствии с таблицей 7.

Таблица 7 - Класс молока по сычужной пробе

Молоко с оценкой "хорошее" и "удовлетворительное" (1 и 2 класса, соответственно) считается сыропригодным, молоко с оценкой "неудовлетворительное" (3 класс) - несыропригодным.

1-2 капли нейтрализованной культуральной жидкости пипеткой переносят на предметное стекло и после выдержки на воздухе в течение 30 мин добавляют к ней каплю 3% раствора перекиси водорода.

Если в посевах обнаружены газообразующие микроорганизмы, то при определении их каталазной активности ставят контрольную пробу аналогично пробе на каталазу, но без добавления перекиси водорода. В данном случае газообразующие микроорганизмы относят к каталазоположительным при отсутствии пузырьков газа в контрольной пробе или при явно повышенном газообразовании в пробе с перекисью водорода по сравнению с контрольной пробой.

Обработка результатов

При появлении на стекле пузырьков газа через 30-60 с считают, что они образовались в результате разложения перекиси водорода каталазой, образуемой микроорганизмами (Приложение Г ).

6.5.7.1 Определение БГКП на среде Кесслер

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу при температуре (37±1) °С в течение 24 ч с образованием кислоты и газа и предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Посев в среду Кесслер

В среду Кесслер проводят посев продуктов в количествах, указанных в таблице 11.

Таблица 11 - Объем или масса засеваемого продукта при определении БГКП на среде Кесслер

По 1 см соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см среды Кесслер.

Посев 10 см пастеризованного молока, отобранного после пастеризатора, и 10 см закваски проводится в колбочки с 40-50 см среды Кесслер.

Культивирование

Пробирки с посевами помещают в термостат при (37±1) °С на 18-24 ч. При исследовании продуктов, хранящихся при минусовой температуре, пробирки с посевом выдерживают в термостате при (37±1) °С в течение 48 ч.

Обработка результатов

Просматривают пробирки или колбы с посевами и определяют наличие бактерий группы кишечных палочек по газообразованию. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии БГКП. При наличии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов считается, что БГКП обнаружены в нем.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на жидкой среде Кесслер представлена в приложении Г.

6.5.7.2 Определение БГКП на плотной среде Кесслер

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу при температуре (37±1) °С в течение 24 ч с образованием кислоты и газа, которое фиксируется разрывами столбика среды. Метод применяется для внутрипроизводственного контроля и предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

В пробирку с расплавленной и охлажденной до 40-50 °С плотной средой Кесслер вносят 1 см разведения продукта; а при взятии смыва - весь смывной раствор вместе с тампоном. Затем путем встряхивания пробирки хорошо размешивают среду с внесенным посевным материалом, дают ей застыть.

Культивирование

Посевы помещают в термостат с температурой (37±1) °С на 18-24 ч.

Обработка результатов

При наличии небольшого количества бактерий группы кишечных палочек в плотной среде Кесслер появляются трещины, при большом количестве этих бактерий в среде образуются пузырьки газа и агар разрывается.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на плотной среде Кесслер представлена в приложении Г.

6.5.7.3 Определение количества БГКП на среде АЖФК

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП образовывать типичные колонии на плотной среде при температуре (37±1) °С в течение 24 ч и предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей готового продукта, в частности сыра, и выявления источника микробиологической порчи.

Проведение посева

Перед выполнением поверхностного посева среду расплавляют на водяной бане (или пользуются свежеприготовленной средой), охлаждают до 50 °С и разливают в стерильные чашки Петри примерно по 10-12 см, чтобы среда ровно покрывала дно чашки. Чашки оставляют полуоткрытыми на 1 ч для подсушивания. Потом закрывают, маркируют и используют для анализа.

Разведения пастеризованного молока, сыра готовят в соответствии с таблицей 12. Каждое из выбранных разведений засевают по 0,1 см поверхностным способом. После посева чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой 37 °С на 16-24 ч, но не более 24 ч. Подсчитывают розовато-фиолетовые колонии диаметром больше 0,5 см с более светлым по сравнению с центром ореолом.

Таблица 12 - Объем или масса засеваемого продукта при определении БГКП на среде АЖФК

Посев на АЖФК можно проводить глубинным способом. Каждое разведение должно быть засеяно на 1 см в отдельную чашку Петри и залито расплавленным и охлажденным до 45 °С агаром желчным фиолетово-красным.

Сразу после заливки агара содержимое чашки следует тщательно перемешать путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат при температуре (37±1) °С на 16-24 ч.

При определении БГКП в других молочных продуктах на среде АЖФК для проведения посева рекомендуется выбирать разведения, начиная с того, в котором БГКП должны отсутствовать, и два предыдущих.

Обработка результатов

При поверхностном посеве число колоний, выросших на каждой чашке Петри, для подсчета БГКП в 1 г или 1 см образца, умножают на 10 и на соответствующее разведение.

При глубинном посеве число колоний, выросших на каждой чашке, пересчитывают на 1 г или 1 см продукта с учетом разведения.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на среде АЖФК представлена в приложении Г.

6.5.7.4 Индикация БГКП на среде КОДА

Сущность метода

Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу при температуре (37±1) °С в течение 24 ч с образованием кислоты, что приводит к изменению цвета индикатора с зеленого на желтый при развитии цитратотрицательных БГКП. Метод предназначен для оценки санитарно-гигиенических условий производства и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Смывную жидкость с тампоном или тампон, которым отбирали смыв, помещают в пробирки с 5 см среды КОДА.

Культивирование

Пробирки с посевами помещают в термостат при (37±1) °С на 18-24 ч.

Обработка результатов

Просматривают пробирки с посевами и определяют наличие бактерий группы кишечных палочек по изменению окраски. При отсутствии изменения окраски дают заключение об отсутствии бактерий группы кишечных палочек в смыве.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на среде КОДА представлена в приложении Г.

6.5.7.5 Метод дифференциации энтеробактерий на среде Эндо

Сущность метода

Метод основан на способности ферментирующих лактозу энтеробактерий (БГКП) образовывать на среде темно-красные колонии с характерным металлическим блеском вследствие взаимодействия образующихся альдегидов с фуксином в присутствии сульфита натрия при температуре (37±1) °С в течение 24 ч. Метод предназначен для дифференциации энтеробактерий по виду образуемых на среде колоний.

Проведение анализа

На среду Эндо делают посевы с накопительных сред (Кесслер, КОДА, ГПС, ЛПС) с признаками роста БГКП.

Перед выполнением посева среду по 4.6.2.6 расплавляют на водяной бане (или пользуются свежеприготовленной средой), охлаждают до 50 °С и разливают в стерильные чашки Петри примерно по 10-12 см, чтобы среда ровно покрывала дно чашки. Чашки со средой подсушивают по 5.6.2, закрывают, маркируют и используют для анализа.

Из пробирок и/или колбочек с накопительными средами с признаками роста БГКП, проводят посев петлей на среду Эндо. Исследуемый материал отбирают бактериальной петлей. Бактериальную петлю кладут на поверхность питательной среды и проводят штрихи по поверхности среды, располагая штрихи как можно ближе друг к другу для получения в конце штриха изолированных колоний. Для выполнения нескольких посевов на одной чашке дно чашки предварительно делят на равные сектора (рекомендуется не более 4 секторов). Техника посева описана в 5.6.2.2.

Культивирование

Чашки с посевами переворачивают вверх дном и помещают в термостат при (37±1) °С на 18-24 ч.

Обработка результатов

Результаты посевов оценивают визуально по характеру образовавшихся колоний:

- образование красных или темно-красных колоний с металлическим блеском на среде Эндо свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоположительным энтеробактериям (БГКП);

- образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний свидетельствует о принадлежности микроорганизмов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоотрицательным энтеробактериям.

При появлении на среде полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний необходимо проводить контроль на предмет наличия патогенных энтеробактерий (сальмонеллы, шигеллы). Контроль проводится в лабораториях, лицензированных на право работы с патогенными микроорганизмами.

Чашки с посевами упаковываются в стерильную бумагу и/или контейнеры и передаются в лаборатории, лицензированные на право работы с патогенными микроорганизмами, для дальнейшего контроля.

Картина роста тест-культуры E.coli на среде Эндо представлена в приложении Г.

6.5.7.6 Определение БГКП с использованием микробитестов для определения редуцирующих бактерий

Сущность метода

Метод предназначен для контроля БГКП, коррелирующих с содержанием редуцирующих тетразолий хлористый бактерий, в неферментированных молочных продуктах (масле) и смывах с оборудования и основан на изменении цвета индикатора 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ) при развитии редуцирующих бактерий, в том числе БГКП.

Проведение анализа

Из светонепроницаемого пакета, содержащего полиэтиленовые пакеты с микробитестами, вынимают один пакет с микробитестом и с одной стороны разрезают его ножницами. Микробитест вместе с полиэтиленовым пакетом перегибают вдоль по середине, вынимают из пакета, беря за перфорированный конец. Микробитест смачивают в исследуемом разведении путем однократного погружения, которое длится 5 с. Излишек влаги удаляют путем прикосновения конца микробитеста к стенке пробирки или колбы с разведением. При намачивании микробитест впитывает 0,2 см разведения продукта или смыва. Затем микробитест вновь помещают в полиэтиленовый пакет, перфорированный конец удаляют. После помещения микробитеста в пакет для удаления воздуха из пакета его следует тщательно прогладить рукой, чтобы полиэтиленовая пленка с обеих сторон плотно прилегла к смоченному микробитесту. Разрезанную сторону пакета зажимают между двумя пластинками из негорючего материала, запаивают на пламени горелки и помещают в пакет из светонепроницаемого материала.

Культивирование

Пакет из светонепроницаемого материала с микробитестом помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение (43±2) ч. Микробитест в термостате должен находиться в строго горизонтальном положении.

Обработка результатов

После культивирования проводят подсчет колониеобразующих единиц (красных точек) на обеих сторонах микробитеста.

Количество редуцирующих бактерий в 1 см (г) исследуемого объекта подсчитывают по формуле

,                                               (2)

где - количество колониеобразующих единиц (красных точек) на микробитесте;

- разведение продукта.

Примечания.

Если подсчет невозможно провести сразу по извлечении микробитеста из термостата, микробитест хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.

Микробитесты для определения редуцирующих бактерий хранят только в светонепроницаемых пакетах, а при работе предохраняют от действия солнечного света. Микробитесты для определения редуцирующих бактерий должны иметь белый или слегка кремовый цвет. Розовый цвет микробитеста указывает на его засвеченность, и для проведения испытаний он не пригоден.

Картина роста бактерий группы кишечных палочек на микробитесте представлена в приложении Г.

6.5.8.1 Определение количества дрожжей и плесневых грибов на плотных питательных средах

Сущность метода

Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта и (или) их разведений в питательные среды (среда Сабуро, среда агаровая для определения дрожжей и плесеней и др.), определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам и дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток. Метод предназначен для оценки санитарно-гигиенических показателей сырья, производственного процесса, готового продукта и выявления источника микробиологической порчи продукта.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

Посев

Из каждой пробы делают посев по 1 см продукта или его соответствующих разведений на 2-3 чашки Петри. В каждую чашку с заранее промаркированной крышкой добавляют не позднее чем через 15 мин (14±1) см питательной среды, охлажденной до (45±1) °С, содержимое чашки Петри немедленно тщательно перемешивают и оставляют на горизонтальной поверхности до застывания питательной среды.

Культивирование

После застывания сред чашки Петри переворачивают вверх дном и ставят в таком виде в термостат с температурой (24±1) °С на 5 сут.

Через 3 сут термостатирования проводят подсчет типичных колоний, а через 5 сут окончательный подсчет, наблюдая за ростом дрожжей и плесневых грибов визуально, а при необходимости проводят микроскопирование выросших колоний.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки.

Колонии дрожжей на агаровых средах образуют выпуклые, блестящие серовато-белые колонии с гладкой поверхностью и ровным краем. В среде агаровой для определения дрожжей и плесневых грибов дрожжи могут образовывать глубинные колонии белого цвета звездообразной формы с четким краем.

Плесневые грибы имеют различную окраску и образуют на питательных средах пушистый мицеллий.

При необходимости проводят микроскопические исследования. Препараты готовят способом раздавленной капли и/или способом фиксирования и окрашивания по 6.4.

Результаты микроскопирования оценивают, пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в таблице 13.

Таблица 13 - Характеристика дрожжей и плесневых грибов

Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г или в 1 см продукта вычисляют по формуле

,                                              (3)

где - сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях при условии, что на каждой чашке число колоний отвечает требованиям, указанным выше;

- количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

- количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

- степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Картина роста дрожжей и плесневых грибов на плотных питательных средах представлена в приложении Г.

6.5.8.2 Определение дрожжей и плесневых грибов в атмосфере производственных помещений при производственном контроле с использованием микробитестов

Сущность метода

Метод основан на способности дрожжей и плесеневых грибов образовывать колонии на поверхности микробитестов при температуре (25±1) °С в течение (72±6) ч.

Проведение анализа

Из светонепроницаемого пакета, содержащего полиэтиленовые пакеты с микробитестами, вынимают один пакет с микробитестом и с одной стороны разрезают его ножницами.

Микробитест вынимают из полиэтиленового пакета профламбированным пинцетом, затем его смачивают в стерильной воде и помещают в стерильную чашку Петри.

Чашки Петри со смоченными микробитестами размещают в производственных помещениях, открывают и выдерживают открытыми в течение 5 мин, затем закрывают и помещают в термостат.

Примечание - Микробитесты для определения дрожжей и плесневых грибов хранят только в светонепроницаемых пакетах, а при работе предохраняют от действия солнечного света. Микробитесты должны иметь светло-голубой цвет с зеленоватым оттенком.

Культивирование

Для предотвращения возможного высыхания микробитестов чашки с микробитестами перед термостатированием рекомендуется поместить в полиэтиленовый пакет. Пакеты с чашками помещают в термостат в горизонтальном положении крышками вверх.

Чашки с микробитестами выдерживают в термостате при температуре (25±1) °С в течение (72±6) ч.

Обработка результатов

После термостатирования проводят подсчет колоний дрожжей и плесневых грибов на верхней стороне микробитеста.

Дрожжи растут на микробитестах в виде точек розового или кремового цвета, а плесневые грибы - колониями разной окраски, по внешнему виду аналогично колониям плесневых грибов на агаровой среде для определения дрожжей и плесеней. При появлении на микробитестах колоний, нехарактерных по внешнему виду для колоний дрожжей и плесневых грибов, проводят микроскопирование для выявления и исключения споровых аэробов.

Картина роста дрожжей и плесневых грибов на микробитестах представлена в приложении Г.

6.5.11.1 Выявление термоустойчивых микроорганизмов (молочнокислых палочек и дрожжей) на технологическом оборудовании

Сущность метода

Метод основан на способности термофильных молочнокислых палочек и дрожжей развиваться в молоке при температуре (42±2) °С с образованием сгустка (или без него в случае развития дрожжей) в течение 16-24 ч.

Проведение анализа

Стерильным тампоном, смоченным стерильным раствором хлористого натрия или стерильной водой, протирают исследуемый участок оборудования. Тампон опускают в пробирку со стерильным молоком.

Культивирование

Посевы выдерживают в течение 16-24 ч при температуре (42±2) °С (для выявления палочек) или при (24±1) °С (для выявления дрожжей).

Обработка результатов

После окончания культивирования просматривают пробирки с посевами и готовят микроскопические препараты.

Образование сгустка молока и наличие в микропрепарате палочек свидетельствуют о наличии термофильных молочнокислых палочек.

Наличие дрожжей определяют по микропрепарату.

6.5.11.2 Выявление термоустойчивых микроорганизмов (молочнокислых палочек) в пастеризованном молоке или сливках

Сущность метода

Метод основан на способности термостойких молочнокислых папочек развиваться в молоке при температуре (42±2) °С с образованием сгустка.

Проведение анализа

Готовят разведения исследуемого образца пастеризованного молока или сливок в стерильном растворе хлористого натрия или стерильной воды. Полученные разведения засевают в стерильное обезжиренное молоко по 4.6.2.14 (до 6 разведения).

Культивирование

Посевы выдерживают при температуре (42±2) °С в течение 72 ч.

Обработка результатов

Полученные сгустки микроскопируют и устанавливают наличие в них палочек.

6.6.1.1 Метод определения общего количества молочнокислых микроорганизмов на среде КМАФАнМ

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний молочнокислых микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (30±1) °С в течение 72 ч.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного содержания молочнокислых микроорганизмов в соответствии с таблицей 15.

Таблица 15 - Объем или масса засеваемого продукта при определении молочнокислых микроорганизмов

Посев

Для определения общего количества молочнокислых микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 30 и не более 300 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 15 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14±1) см расплавленной и охлажденной до температуры 40-45 °С питательной средой для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (30±1) °С на 72 ч.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества выросших колоний, пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

6.6.1.2 Метод определения общего количества термофильных молочнокислых микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на подсчете колоний молочнокислых микроорганизмов, вырастающих на плотной питательной среде КМАФАнМ при (45±1) °С в течение 72 ч.

Проведение анализа

Анализ проводится аналогично 6.6.1.1, за исключением температуры культивирования, которая составляет (45±1) °С.

6.6.1.3 Метод определения общего количества молочнокислых микроорганизмов на стерильном молоке

Сущность метода

Метод основан на способности мезофильных молочнокислых бактерий развиваться при температуре (30±1) °С, а термофильных при (45±1) °С в обезжиренном молоке, выделяя кислоту. В результате чего молоко сворачивается, образуя сгусток в течение 72 ч.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева, количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного содержания этих микроорганизмов в продукте.

Посев

Из каждой пробы делают ряд последовательных разведений (до 10). Из последних трех-четырех разведений вносят по 1 см в 2 параллельные пробирки со стерильным обезжиренным молоком (4.6.2.14).

Культивирование

Пробирки с посевами помещают в термостат и выдерживают при температуре (30±1) °С для учета мезофильных молочнокислых бактерий или при температуре (45±1) °С для учета термофильных молочнокислых бактерий. Посевы выдерживают 72 ч.

Обработка результатов

В результате развития молочнокислых микроорганизмов в молоке образуется сгусток. Процесс образования сгустка фиксируется визуально.

Для проведения анализа состава молочнокислых микроорганизмов готовят микропрепараты. По микроскопическому препарату отмечают три последних разведения, содержащие определяемую группу микроорганизмов (палочки или кокки).

При подсчете количества бактерий пользуются методом НВЧ по 5.6.4.

Картина роста мезофильных и термофильных молочнокислых микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.6.1.4 Определение общего количества ароматообразующих микроорганизмов

Сущность метода

Метод основан на способности цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов при развитии их на плотных питательных средах с цитратом кальция в течение 48-72 ч при температуре (30±1) °С образовывать зоны просветления вокруг колоний.

Проведение анализа

Выбор разведений для посева

Количество засеваемого продукта устанавливают с учетом наиболее вероятного содержания ароматообразующих микроорганизмов в соответствии с таблицей 16.

Таблица 16 - Объем или масса засеваемого продукта при определении общего количества ароматообразующих микроорганизмов

Посев

Для определения общего количества ароматообразующих мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов выбирают те разведения, при посевах которых на чашках вырастает не менее 20 и не более 200 колоний. Из каждой пробы делают посев на две-три чашки из разведений, указанных в таблице 16 в соответствии с 5.6.1. Каждое из разведений должно быть засеяно в количестве 1 см в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито (14±1) см расплавленной и охлажденной до температуры 40-45 °С питательной средой, приготовленной по 4.6.2.15. Осадок нерастворимого цитрата кальция в среде перед заливкой чашек необходимо тщательно перемешать до его равномерного распределения в среде.

Культивирование

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде в термостат с температурой (30±1) °С на 48-72 ч.

Обработка результатов

Каждую чашку помещают вверх дном на темном фоне и проводят подсчет количества колоний, образовавших зоны просветления, пользуясь лупой с увеличением в 4-10 раз.

Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

Количество колоний, образовавших зоны просветления, подсчитывают на каждой чашке аналогично 6.5.1.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

Картина роста цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов представлена в приложении Г.

6.6.1.5 Определение молочнокислых микроорганизмов можно проводить на средах, предусмотренных в ГОСТ 10444.11. Данные среды могут быть использованы в качестве арбитражных.

6.6.2.1 Определение количества бифидобактерий в плотных питательных средах

Сущность метода

Метод основан на способности бифидобактерий размножаться в анаэробных условиях на питательных средах при температуре (37±1) °С с образованием типичных колоний.

Проведение анализа

Перед проведением анализа среду по 4.6.2.11, разлитую высоким столбиком, нагревают в кипящей водяной бане до полного расплавления агара в среде и выдерживают в кипящей водяной бане в течение (25±5) мин для снижения в ней растворенного кислорода с целью усиления анаэробных свойств.

При определении бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах перед расплавлением в среду вносят стерильный раствор неомицина (4.5.5.1) или диклоксациллина (4.5.5.2]. После расплавления среды пробирки охлаждают в водяной бане до температуры (45±2) °С.

Готовят разведения продукта с 1 по 7 (при посеве бифидосодержащего БК - с 1 по 9). Для выявления максимально возможного количества бифидобактерий, при необходимости, можно засевать вплоть до 12-го разведения.

Затем из трех-четырех последних разведений берут пипеткой по 1 см и вносят в пробирки со средой. Пипетка с отобранным разведением опускается на дно пробирки, а затем медленно поднимается вращательным движением, таким образом, чтобы тщательно перемешать разведение со средой, не допустить попадание воздуха и ограничить пристеночный рост.

Проводят два параллельных определения.

Выращивание

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение 2-3 сут, в случае определения бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах - 3-5 сут.

Обработка результатов

По окончании инкубирования учитывают последние пробирки, в которых выросли типичные для бифидобактерий колонии - в виде крупных "дисков" или "гречишных зерен". Отмечают разведение и подсчитывают количество выросших колоний.

Подтверждение принадлежности образовавшихся типичных колоний к бифидобактериям проводят методом микроскопирования.

Из типичных колоний последнего разведения готовят мазки, окрашенные метиленовым голубым по 4.4.2.2. При приготовлении микропрепарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю стерильной воды или физраствора и исследуемый материал, взятый с колонии. Материал тщательно размешивают и распределяют на площади около 1 см. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют в пламени горелки и красят метиленовым голубым. Бифидобактерии в препаратах имеют вид тонких, мелкозернистых, слегка изогнутых палочек с утолщениями на концах или без них; располагаются группами, в виде римских пятерок (V), скоплениями в виде китайских иероглифов, и могут образовывать короткие цепочки.

Вычисление содержания живых бифидобактерий в 1,0 см (г) продукта проводят по формуле

,                                                  (4)

где - количество живых бифидобактерий в 1,0 см (г) продукта;

- среднее количество колоний в учитываемом разведении продукта, засеянном в 2 параллельных ряда;

10 - коэффициент децимального разведения;

- показатель разведения продукта, в котором отмечен рост бифидобактерий.

Для определения истинного количества бифидобактерий в среде с неомицином результат следует удвоить.

Картина роста бифидобактерий на плотных питательных средах представлена в приложении Г.

6.6.2.2 Определение количества бифидобактерий в полужидких питательных средах

Сущность метода

Метод основан на способности бифидобактерий давать рост в питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках, с образованием колоний при температуре (37±1) °С в течение 24-72 ч.

Проведение анализа

Перед проведением анализа среду для учета клеток бифидобактерий (4.6.2.12) следует разогреть в кипящей водяной бане в течение (20±5) мин.

При определении бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах перед расплавлением в среду вносят стерильный раствор неомицина (4.5.5). После расплавления пробирки охлаждают в водяной бане до температуры (45±2) °С.

Готовят разведения продукта с 1 по 7 (при посеве бифидосодержащего БК - с 1 по 9).

Затем из трех-четырех последних разведений берут пипеткой по 1 см и вносят в пробирки со средой. Проводят два параллельных определения, при этом пробирки располагают в два параллельных ряда.

Пипетка с отобранным разведением опускается до дна пробирки, а затем медленно поднимается вращательным движением, чтобы тщательно перемешать разведение со средой, не допустить попадания воздуха и ограничить пристеночный рост.

Культивирование

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С в течение (72±1) ч. Допускается предварительный учет через (48±1) ч с последующим окончательным учетом через (72±1) ч.

Обработка результатов

По окончании инкубирования учитывают последние пробирки, в которых выросли типичные для бифидобактерий колонии - в виде "гвоздиков", "вытянутых веретен", иногда в виде "полос", расположенных вдоль пробирки.

Подтверждение наличия бифидобактерий - методом микроскопирования.

Из типичных колоний последнего разведения и со дна пробирки последующего разведения (без видимого роста типичных колоний бифидобактерий) готовят препараты, окрашенные метиленовым голубым (по 4.4.2.2). При приготовлении микропрепарата на чистое предметное стекло наносят петлей небольшую каплю исследуемого материала и распределяют на площади около 1 см. Препарат высушивают при комнатной температуре, фиксируют в пламени горелки и красят метиленовым голубым. Бифидобактерии имеют вид тонких, мелкозернистых, слегка изогнутых палочек с утолщениями на концах или без них; располагаются группами, в виде римских пятерок (V), скоплений в виде китайских иероглифов, могут образовывать короткие цепочки.

Поскольку анализируемые продукты, обогащенные бифидобактериями, являются кисломолочными, в мазках, в зависимости от вида продукта, могут присутствовать микроорганизмы молочнокислых заквасок (молочнокислые лактококки и палочки).

Вычисление содержания живых бифидобактерий в 1,0 см (г) продукта проводят по формуле

,                                                    (5)

где - среднее количество колоний в последнем разведении продукта, засеянном в 2 параллельных ряда:

• 10 - коэффициент децимального разведения;

  - показатель последнего разведения продукта, в котором отмечен рост бифидобактерий.

При обнаружении бифидобактерий микроскопией мазков придонного материала из того разведения, в котором не отмечено видимого роста колоний, учитывают степень этого разведения.

Для определения истинного количества бифидобактерий в среде с неомицином результат следует удвоить.

Картина роста бифидобактерий в полужидких питательных средах представлена в приложении Г.

6.7.1.1 Эффективность пастеризации контролируют в соответствии с требованиями ГОСТ 3623 определением щелочной или кислой фосфатазы, или пероксидазы в зависимости от вида пастеризации (низкотемпературная или высокотемпературная) путем испытания проб молока или продуктов его переработки.

Эффективность низкотемпературной пастеризации контролируют по отсутствию активности щелочной фосфатазы, инактивация которой происходит при температуре не ниже 63 °С с выдержкой 30 мин. Определение щелочной фосфатазы применяют для контроля эффективности пастеризации молока в сыроделии.

Эффективность высокотемпературной пастеризации контролируют по отсутствию активности пероксидазы, которая инактивируется при температуре пастеризации не ниже 80 °С с выдержкой 20-30 с. Определение пероксидазы применяют для контроля эффективности пастеризации при получении продуктов, в технологии производства которых заложены температуры пастеризации более высокие, чем температура инактивации данного фермента.

Эффективность высокотемпературной пастеризации контролируют по отсутствию активности кислой фосфатазы, инактивация которой происходит при температуре не ниже 85 °С с выдержкой 30 мин или при более высоких температурах пастеризации с соответственно меньшим временем выдержки. Определение кислой фосфатазы применяют для контроля эффективности пастеризации молока и сливок в маслоделии.

6.7.1.2 Эффективность пастеризации молока и жидких сырьевых компонентов контролируют микробиологическим методом - путем испытания проб, отобранных после секции охлаждения, на наличие санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП) по 6.5.7.1.

7.3.2.1 Определение общего числа микроорганизмов (ОМЧ)

Сущность метода

Метод основан на определении общего числа мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре или агаре для определения КМАФАнМ при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимых с увеличением в два раза.

Проведение анализа

Пробу воды тщательно перемешивают, вносят в чашки Петри по 1 см и проводят посев в соответствии с 5.6.1. При этом из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 см.

Обработка результатов

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в два раза. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 см исследуемой пробы воды.

Если подсчет отдельных колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают сплошной рост.

Общее число микроорганизмов (ОМЧ) должно составлять не более 50 КОЕ/см . При получении неудовлетворительных результатов проводится усиленная обработка воды и повторный анализ.

7.3.2.2 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)

Сущность метода

Метод основан на концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранном фильтре, выращивании их при (37±1) °С на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа

Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры N 2 или N 3, а также планктонные фильтры N 6, проверенные на отсутствие трещин, отверстий и т.п., помещают по одному на поверхность дистиллированной воды, нагретой до 80 °С в стакане (в чашке для выпаривания, эмалированной кастрюле и др.) и медленно доводят до кипения на слабом огне, после чего воду заменяют и кипятят 10 мин. Смену воды и последующее кипячение повторяют 3-5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры хранят сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой. Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.

Фильтрующие мембраны "Владипор" марки МФА-МА NN 5, 6, 7, 8 и 10, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и т.п., стерилизуют кипячением. При этом во избежание скручивания мембран необходимо соблюдать следующие правила. На дно стакана или другой емкости, в котором проводят кипячение, помещают "сторож для молока" или нержавеющую сетку для ограничения бурного кипения. Дистиллированную воду заливают в стакан или емкость в небольшом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран. Однако вода должна покрывать предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны. Дистиллированную воду доводят в сосуде до 80-90 °С, после чего, убавив нагрев, на поверхность воды по одной помещают фильтрующие мембраны. Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10-15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством (чтобы покрыть фильтрующие мембраны) стерильной дистиллированной воды. После чего фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимости проводят повторное кипячение фильтрующих мембран.

Подготовка фильтровального аппарата к анализу

Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

Выполнение анализа

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 см.

При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см воды).

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры.

Фильтры помещают на среду Эндо. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые колонии, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ И ТКБ в 100 см исследуемой воды.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их возможной принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:

- все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;

- не менее 3-4 колоний каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

- наличие оксидазной активности;

- окраску по Граму по 6.4.1;

- ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Постановка оксидазного теста проводится по 6.3.2.

При контроле качества воды оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий.

При положительном результате колонию из дальнейшего исследования исключают.

Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.

Определение ферментации лактозы

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой (лактозопептонной или полужидкой средой с лактозой) по 4.6.2.4:

- для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч;

- для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно подогретую до температуры 43-44 °С, и инкубируют при температуре (44,0±0,5) °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах возможен через 4-6 ч.

При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ продолжают инкубировать до 24 ч.

Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата продолжают инкубировать до 48 ч для окончательного учета.

Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение 18-24 ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты.

Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

Если проведенные тесты дают положительный результат о принадлежности исследованных колоний к ОКБ (оксидазоотрицательные, грамотрицательные, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа), то мы говорим о присутствии ОКБ в исследованном объеме.

Обработка результатов

При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают "не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см" и "не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см".

После идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают числом КОЕ в 100 см воды.

7.3.2.3 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Титрационный метод может быть использован:

- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Сущность метода

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Проведение анализа

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпидемнадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 см исследуемой воды.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе проводят посев: 3 объемов по 100 см, 3 объемов по 10 см и 3 объемов по 1 см.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную или глюкозо-пептонную среду, приготовленные по 4.6.2.4. Посев 100 см и 10 см воды проводят в 10 см и 1 см концентрированной среды, посев 1 см пробы проводят в 10 см среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение 24 ч при проведении анализа на среде ГПС и 48 ч при проведении анализа на среде ЛПС. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посева. Из емкостей, где отмечено помутнение, изменение окраски (кислотообразование) и образование газа, а также помутнение и кислотообразование при использовании ГПС или помутнение при использовании ЛПС, проводят посев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (4.6.2.6), разделенной на 3-4 сектора (5.6.2.2), для получения изолированных колоний. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний.

Емкости без признаков роста на среде ЛПС оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшие исследования с ними не проводят. Из посевов, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 18-20 ч.

При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат.

При образовании помутнения, газа и изменения цвета в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде (изменение цвета среды под колонией), дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

- если в среде накопления отмечено только помутнение;

- если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

В этих случаях:

- проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;

- выполняют оксидазный тест;

- подтверждают принадлежность к Граму по 6.4.1;

- подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по 4.6.2.4 с последующей инкубацией посевов при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми методами.

Отрицательный ответ дают, если:

- в среде накопления нет признаков роста;

- на секторах среды Эндо нет роста;

- на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т.п.);

- все колонии оказались оксидазоположительными;

- все колонии оказались грамположительными;

- если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44±1) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4-6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный результат на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допускается для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ проводить посев 1 см из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирки с лактозо-пептонной средой с поплавком по 4.6.2.4 и предварительно прогретые до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44±1) °С в течение 24 ч. При обнаружении изменения окраски индикатора и образования газа дают положительный ответ.

Обработка результатов

При исследовании 3 объемов по 100 см результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в журнале: "обнаружены в 100 см".

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице 19.

Таблица 19 - Расчет наиболее вероятного числа бактерий в 100 см питьевой воды

Результат представляют без доверительного интервала.

При отрицательном результате на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе "не обнаружены в 100 см".

Микробиологические показатели безопасности питьевой воды при контроле в условиях производственной лаборатории представлены в таблице 20.

Таблица 20 - Микробиологические показатели безопасности питьевой воды

Периодичность контроля:

- зависит от вида водоснабжения (централизованное или собственное) и вида выпускаемой продукции (непосредственное использование воды в ходе технологического процесса или для технических целей) и проводится 4-12 раз в год,

- усиленный контроль показателей проводят при появлении тех или иных характерных органолептических пороков продуктов или при снижении их хранимоспособности.

Картина роста БГКП на средах ГПС и ЛПС приведена в приложении Г.

10 см исследуемого образца, предварительно освобожденного от белка, помещают в стерильную пробирку, добавляют (1,2±0,2)% хлороформа с помощью пипетки с резиновой грушей или шприца или другого приспособления, предотвращающего непосредственный контакт работающего с хлороформом. Пробирку закрывают ватной пробкой, смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение (12±2) мин. Работы с хлороформом необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Стерильной пипеткой с грушей или шприцем, не захватывая нижний слой с хлороформом, отбирают верхнюю часть смеси и переносят в стерильную пробирку.

Выделение бактериофага путем температурного воздействия

Пробу прогревают в водяной бане при температуре (65±1) °С в течение (25±5) мин и далее фильтруют через стерильный бумажный или ватно-марлевый фильтр или центрифугируют для удаления белкового осадка.

Выделение бактериофага из производственной атмосферы

Выделение проводят путем прямого осаждения фаговых частиц на чашки Петри с питательной средой и тест-культурами или с помощью аппарата Кротова (или его аналогов).

1 Воздействие бактериофага на тест-культуру в гидролизованном молоке может проявляться в первоначальном нормальном развитии тест-культуры в опытной пробирке (помутнение питательной среды в первые 3-5 ч) с последующим просветлением культуральной среды.

2 Контроль за развитием тест-культур может быть осуществлен как визуально, так и по оптической плотности, определяемой с помощью ФЭК или другой спектрофотометрической аппаратуры.

3 Для подтверждения присутствия бактериофага в исследуемой пробе из опытной пробирки делают высев и испытания на плотных питательных средах по одному из методов 8.2.1.

Б Обнаружение бактериофагов с использованием в качестве питательной среды стерильного молока

В колбы с (95,0±5,0) см стерильного молока вносят по 0,1-0,2 см тест-культур и тщательно перемешивают круговыми движениями. В колбы, шифрованные как опытные, добавляют по (10,0±1,0) см пробы, подготовленной по 8.1.3. В колбы, шифрованные как контрольные, вносят по (10,0±1,0) см стерильной воды.

Контрольные и опытные колбы помещают в термостат и выдерживают при оптимальной для жизнедеятельности тест-культур температуре (таблица 21), определяя титруемую кислотность молока через 0 (исходная), (6,0±0,5) ч, (12,0±1,0) ч и (22,0±2,0) ч, рассчитывая прирост титруемой кислотности () за указанные выше промежутки времени (т.е. за 6 ч - ; за 12 ч - ; и за 22 ч - по формуле

,                                                 (7)

где - прирост титруемой кислотности за определенный промежуток времени (), °Т;

- исходная титруемая кислотность, °Т;

- титруемая кислотность через ч, °Т.

Достоверное торможение кислотообразования тест-культур в опытных колбах (или в одной из опытных колб) по сравнению с соответствующими контрольными свидетельствует о наличии в исследуемой пробе бактериофага к тест-культуре.

Торможение считается достоверным, если различия в приросте титруемой кислотности в контрольной и опытной колбах составляют через (6,0±0,5) ч - не менее 3 °Т, через (12,0±1,0) ч - не менее 5 °Т, через (22,0±2,0) ч - не менее 8 °Т.

Предварительно учет результатов проводят через (6,0±0,5) ч. При получении недостаточно четких результатов (близких к критическим) опытные и контрольные колбы выдерживают еще 6 ч, а при необходимости - до 24 ч.

Для подтверждения наличия бактериофага в опытных колбах проводят исследования одним из методов по 8.2.1 с использованием индикаторных чашек с теми же тест-культурами.